遺伝子操作による大豆アレルゲンタンパク質の遺伝的除去に関する基礎研究

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ダイズ種子タンパク質の中でも主要なアレルゲンである、34KDタンパク質cDNAのクローニングを行った。34KDタンパク質の3｀末端の塩基配列と相補的なオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてcDNAを合成した。cDNAをプラスミドベクターに組み込んで作成したミニライブラリーのクローンをランダムにとり制限酵素分析を行った。34KDタンパク質cDNAと同一と思われるクローン:1-24、2-22について部分的に塩基配列を決定し、34KDタンパク質cDNAであることが確かめられたので、全塩基配列を決定した。1-24は34KDcDNAより5｀方向に約1400bp長く、2-22は約30bp短かった。2-22の5｀側からExoIIIとMung Bean Nucleaseとを用いて約100bpおきにディレーションをおこさせたクローンのシリーズを作成し、それぞれのクローンの5｀末端の塩基配列を決定した後に、インサートを発現ベクターpRSET A、B、Cに、読み枠に従ってライゲーションした。T7RNApolymerase遺伝子を組み込んだM13を感染させることによって、各ディレーションクローンに対するポリペプチドを大腸菌で発現させた。ポリペプチドの発現はSDS-PAGEによって確認することが出来た。34KDタンパク質に対するモノクローナル抗体を用いてイムノブロットを行い、モノクローナル抗体のエピトープ部位を決定した。現在アレル-ギ-患者のIgE抗体を用いてイムノブロット行い、エピトープ構造の解析を行っている。