放線菌に高頻度出現するSSI様プロテアーゼヒビターの生理的意義の解明

阐明放线菌中频繁出现的 SSI 样蛋白酶抑制剂的生理意义

• 批准号: 05760082
• 负责人: 田口 精一
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Tokyo University of Science
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05760082/
• 关键词: 放線菌; streptomycetes; Streptomyces subtilisin inhibitor; SSI様インヒビター; 一次構造解析; 阻害特性; プロテアーゼ; タンパク質間相互作用

当初の研究実施計画にしたがい、まず約20種のSSI様インヒビター(SIL)生産菌より精製単離したSILタンパク質の部分的あるいは全体的な一次構造決定を行った。その結果、(1)beta1〜5シートによって形成される構造ドメイン部分、(2)29Arg-113Pheの塩結合、(3)2カ所のS-S結合、(4)15Thr(Ser)-90Argの静電的相互作用部分、(5)2量体形成に関与する13Val、(6)反応部位を後方から支える99Asn、(7)反応部位近傍のP2'Phe(Tyr)-P4'Proのパッキング部分など、SSIの機能構造を形成する上で重要と考えられた部分は高度に保存されていることがわかった。一方、アミノ酸置換・挿入・欠失が分子表面(特にフレキシブルループ)で認められ、それはSIL1とSIL8に顕著であった。また反応部位近傍の配列に差異があり、トリプシンやキモトリプシンに対して阻害能を示すものもあった。すなわち、標的プロテアーゼの基質特異性とこの領域との間に強い相関性のあることがわかった。また、インヒビターの構造相同性と生産菌種間の近縁関係と良い反応があったので、SILインヒビターが進化系統樹作成の生化学的な指標になると考えている。次に、SSI非生産変異細胞が生産増大するようになったプロテアーゼのうちSSIと相互作用するもの(SAM-P20と命名)の精製・単離を試み、N末端20残基の配列が既知のS.griseus proteaseAおよびBのそれらと高い相同性のあることがわかった。また、クローン化したSAM-P20遺伝子構造から本タンパク質がプレプロ型の前駆体として分泌生産されることが推定された。培養初期に出現するSAM-P20mRNAの鎖長は約2600塩基と長く、発現制御遺伝子とオペロンを成していることが推測され現在解析を進めている。SSIの“真の標的酵素"SAM-P20の過剰生産が実現すると、本来のSILインヒビター群の生理的意義の解明に迫れると考えている。

In the initial research implementation plan, about 20 kinds of SSI samples were produced, and the quality of the samples was determined. The results are as follows: (1) beta15-mer structure formation part,(2) 29Arg-113Phe binding part,(3) S-S binding part,(4) 15Thr (Ser)-90Arg electrostatic interaction part,(5) 13Val structure formation part,(6) 99Asn structure formation part,(7) P2 'Phe (Tyr)-P4' Pro structure formation part,(8) P2'Phe(Tyr)-P4' Pro structure formation part,(9) P2'Phe(Tyr)-P4'Pro The functional structure of SSI is highly conserved. One side, the acid replacement, the insertion, the loss of molecular surface (especially the SIL1 and SIL8), the recognition, the recognition. The difference in the arrangement of the opposite parts shows that The matrix specificity and the strong correlation between the domain and the target are discussed. The structural identity and close relationship between the production species are discussed in detail below. The alignment of the N-terminal 20 residues of the known S.griseus protease A and B is highly identical. The SAM-P20 gene structure is presumed to be the precursor of the original protein. SAM-P20mRNA lock length is about 2600 bp in the early stage of culture, and the expression of SAM-P20 mRNA is expected to be analyzed in the middle of the culture. The production of SSI's "true target enzyme"SAM-P20 is realized, and the physiological significance of the original SIL protein group is explained.

项目成果

Seiichi Taguchi: "Comparative studies on the primary structures and inhibitory properties of subtilisin-trypsin inhibitors from Streptomycetes" European Journal of Biochemistry. (in press). (1994)

Seiichi Taguchi：“来自链霉菌的枯草杆菌蛋白酶-胰蛋白酶抑制剂的主要结构和抑制特性的比较研究”欧洲生物化学杂志。

Seiichi Taguchi: "Isolation and partial characterization of SSI-like protease inhibitors from Streptomyces" FEMS Microbiology Letters. 99. 293-298 (1992)

Seiichi Taguchi：“链霉菌中 SSI 样蛋白酶抑制剂的分离和部分表征”FEMS 微生物学快报。

Seiichi Taguchi: "Improved leader and putative terminator sequences for high-level production of Streptomyces subtilisin inhibitor in Escherichia coli" Applied Microbiology and Biotechnology. 39. 732-737 (1993)

Seiichi Taguchi：“改进的前导序列和推定终止序列，用于在大肠杆菌中高水平生产链霉菌枯草杆菌蛋白酶抑制剂”应用微生物学和生物技术。

Seiichi Taguchi: "Effect of downstream message secondary structure on the secretory expression of Streptomyces subtilisin inhibitor" FEMS Microbiology Letters. 107. 185-190 (1993)

Seiichi Taguchi：“下游信息二级结构对链霉菌枯草杆菌蛋白酶抑制剂分泌表达的影响”FEMS 微生物学快报。