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ヒトNADH-シトクロムb_5還元酵素の電子伝達の分子機構

人NADH-细胞色素b_5还原酶电子转移的分子机制

基本信息

批准号：
05770086
负责人：
調恒明
金额：
$ 0.77万
依托单位：
大分医科大学
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05770086/
关键词：
NADH-シトクロムb_5還元酵素電子伝達部位特異的変異法

项目摘要

ヒトNADH-シトクロムb_5還元酵素(b_5R)について以下のことを明らかにした。従来、化学修飾法により示唆されていたLys-110のNADH結合における役割について大腸菌における大量発現系を利用し、部位特異的変異法により本残基を種々のアミノ酸残基におきかえることにより、Lys-110の正電荷がNADHとの結合に重要であることを示した(Fujimoto et al.FEBS Letters)。本酵素の欠損によって起こる遺伝性メトヘモグロビン血症の重症型患者(横浜)の遺伝子解析を行ない、Phe-298をcodeするTTC3残基の欠失を見い出した。そこで部位特異的変異法を用いてPhe-298の欠失した変異酵素F298△の性質を調べた。この変異酵素の反応効率(kcat/km)は、野生型の約0.4%に低下しており、かつ熱安定性も顕著に低下していた。このことから、Phe-298の欠失が本患者における疾病の原因であると結論した。ところで本酵素と類似性がありX線回析による立体構造の明らかにされているFerredoxin-NADP^+ reductaseでは、C末端のTyr-314がFADとの結合に重要であると考えられている。そこでb_5RについてPhe-298、およびC末端のPhe-300の役割をそれぞれLeu,Alaに置換することにより検討した。その結果、F298A,F300A及びdouble mutantであるF298L/F300Lは、野生型と区別できない活性を持つことが明らかとなった。ところがF298A/F300Aのmutantのkcat/kmは低下していたことから、C末端298および300番目の残基の疎水性が、酵素活性に重要であると考えられた(Shirabeet al.J.Biol.Chem.).また、申請者の共同研究者の高野らは、X線回析法によりb_5Rの3次構造を決定した(Takano et al.Flavins and Flavoproteins)。

ヒトNADH-シトクロムb_5 reduction enzyme (b_5R) について下のことを明らかにした. Origin, chemical modification method, Lys-110 NADH binding method, cutting coliform bacteria, large amounts of Escherichia coli, and site-specific modification method. Lys-110 The positive charge is NADH and the combination is important (Fujimoto et al. FEBS Letters). The deficiency of this enzyme is caused by the disease of patients with severe disease (Yokohama) who suffer from severe disease caused by malnutrition syndrome.伝子analyzes を行ない, Phe-298をcodeするTTC3 residue の无码を见い出した. The part-specific transformation method uses the enzyme F298△のproperty of いてPhe-298. The reaction efficiency (kcat/km) of the isozyme is low, the wild type is about 0.4% low, and the thermal stability is low. The cause of the patient's disease and the conclusion of Phe-298's disease. Ferredoxin-NADP^+ reductase, C-terminal Tyr-314, FAD, binding, important, and test.そこでb_5R についてPhe-298, およびC-terminal のPhe-300の丫 Cut をそれぞれLeu, Alaに replacement することにより検した. The results of その, F298A, F300A and びdouble mutant であるF298L/F300Lは, the difference between wild type and できないactivity をhold つことが明らかとなった.ところがF298A/F300Aのmutantのkcat/kmはlow していたことから、C terminal 298および300号の疎水性が、Enzyme activity is important であると考えられた(Shirabeet al.J.Biol.Chem.), the applicant's co-investigator, Takano Takano, and the X-ray back analysis method, 3rd structure determination of b_5R (Takano et al. Flavins and Flavoproteins).