膜透過したタンパク質の膜からの放出に関する研究

我々は、スフェロプラストを用いてタンパク質膜透過の後期段階を解析する糸を確率し、SecDが膜透過したタンパク質の膜からの放出に関与していることを示した。本年度は、SecD-deficient大腸菌のスフェロプラストを用いてタンパク質膜透過機構を解析した結果、新しい知見が得られた。araBADプロモーター支配下にsecD-secF遺伝子がクローン化されたプラスミドを保持するDELTA(secD-secF)株は、アラビノース非存在下で生育させるとSecDのみがdeficientな状態になっていた。この大腸菌ではOmpA前駆体が蓄積した。ところがこの大腸菌をスフェロプラスト化すると、OmpA前駆体の蓄積はみられず培地中へ分泌された。この結果は、SecDがなくてもOmpAの膜透過及び膜からの放出は見かけ上正常に行われることを示すと共に、ペリプラズム因子がOmpA前駆体の蓄積に関与している可能性を示唆していた。そこでペリプラズム画分存在下で同様の実験を行った結果、OmpA前駆体が蓄積した。このことより、ペリプラズム因子がタンパク質の膜透過および膜からの放出を調節していると考えられた。大腸菌主要外膜リポタンパク質(Lpp)の外膜への局在化機構は、多くの研究者の努力にもかかわらず、ほとんど明らかにされていない。スフェロプラストで合成されたLppは脂肪酸の付加とシグナルペプチドの切断を受けた成熟体として細胞質膜にとどまり、ペリプラズム画分を添加することによって膜から遊離することを見出した。Lppを細胞質膜から遊離させるタンパク質をペリプラズム画分から精製した。

我々は、スフェロプラストを用いてタンパク質膜透過の後期段階を解析する糸を確率し、SecDが膜透過したタンパク質の膜からの放出に関与していることを示した。本年度は、SecD-deficient大腸菌のスフェロプラストを用いてタンパク質膜透過機構を解析した結果、新しい知見が得られた。araBADプロモーター支配下にsecD-secF遺伝子がクローン化されたプラスミドを保持するDELTA(secD-secF)株は、アラビノース非存在下で生育させるとSecDのみがdeficientな状態になっていた。この大腸菌ではOmpA前駆体が蓄積した。ところがこの大腸菌をスフェロプラスト化すると、OmpA前駆体の蓄積はみられず培地中へ分泌された。この結果は、SecDがなくてもOmpAの膜透過及び膜からの放出は見かけ上正常に行われることを示すと共に、ペリプラズム因子がOmpA前駆体の蓄積に関与している可能性を示唆していた。そこでペリプラズム画分存在下で同様の実験を行った結果、OmpA前駆体が蓄積した。このことより、ペリプラズム因子がタンパク質の膜透過および膜からの放出を調節していると考えられた。大腸菌主要外膜リポタンパク質(Lpp)の外膜への局在化機構は、多くの研究者の努力にもかかわらず、ほとんど明らかにされていない。スフェロプラストで合成されたLppは脂肪酸の付加とシグナルペプチドの切断を受けた成熟体として細胞質膜にとどまり、ペリプラズム画分を添加することによって膜から遊離することを見出した。Lppを細胞質膜から遊離させるタンパク質をペリプラズム画分から精製した。