新しい循環調節薬としてのエンドセリン変換酵素抑制薬開発のための研究

新型循环调节药物内皮素转换酶抑制剂的开发研究

• 批准号: 06557008
• 负责人: 真崎 知生 (1995)
• 金额: $ 9.28万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Developmental Scientific Research (B)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 1996
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06557008/
• 关键词: エンドセリン変換酵素; エンドセリン; 金属プロテアーゼ; 内皮細胞; ビッグエンドセリン

エンドセリン(ET)は内皮細胞内でアミノ酸212残基の前駆体(ヒトの場合)より、アミノ酸38残基の中間体(bigET-1)を経て生合成される。bigET-1は血管収縮活性がほとんどない。したがってbigET-1からET-1への変換は生理的に重要であると考えられる。この変換を仲介するエンドセリン変換酵素(ECE)が実際に存在することは今までの研究からわかっていた。本研究計画ではこの変換酵素のcDNAを単離し、発現させ、その基礎的性質を調べ、変換酵素抑制薬開発の基礎とすることを目的とする。本年度はまずこのcDNA単離のための方法として、逆溶血反応法を開発した。ETを分泌していないCHOK1細胞にウシ内皮細胞cDNAライブラリーをトランスフェクトさせる。一方、ET-1の抗体を赤血球に結合させ、このET-1を分泌するCHO-K1細胞を溶血反応を指標として探索した。これによってウシ内皮細胞ET-1cDNAを分泌するCHO-K1細胞を単離し、最終的にECEcDNAを単離した。その結果ECEは蛋白部分の分子量約8万、膜貫通部位を1ケ所もち、亜鉛結合部位を持つ。中性エンドペプチターゼときわめて構造の似た金属プロテアーゼであることがわかった。さらにC末端側に10個のグリコシレーション部位を持つことから、C末端部を細胞外に持ち、したがつて活性部位を細胞外に持つと考えられる。さらにこのECEはbigET-1に特異的であるが、この他にET-3に特異的なECEも存在することがわかった。

エ ン ド セ リ ン (ET) は endothelial cells で ア ミ ノ acid residue 212 before の 駆 body (ヒ ト の) よ り, ア ミ ノ acid residues 38 の intermediates (bigET - 1) を 経 て biosynthesis さ れ る. bigET-1 がほとん vasoconstrictive activity がほとん な がほとん. Youdaoplaceholder0 たがってbigET-1 らET-1へ <s:1> the に important であると study えられる of the physiology of transformation えられる. こ の variations in を placement す る エ ン ド セ リ ン variations in enzymes (ECE) が be interstate に exist す る こ と は today ま で の research か ら わ か っ て い た. This research project で は こ の variations in enzyme の cDNA を 単 し, 発 now さ せ, そ の based を adjustable べ, variations in the properties of enzyme inhibition 薬 open 発 の based と す る こ と を purpose と す る. In this year, the まず まず <s:1> cDNA単 was isolated from the <s:1> ため method と て and the reverse hemolysis 応 method を was used to develop the た. Secretion of ET を し て い な い CHOK1 cells に ウ シ endothelial cells cDNA ラ イ ブ ラ リ ー を ト ラ ン ス フ ェ ク ト さ せ る. Side, ET - 1 の を red blood cell antibodies に combining さ せ, こ を の ET - 1 secretion す る CHO cells - K1 を hemolysis anti 応 を index と し て explore し た. こ れ に よ っ て ウ ET - 1 シ endothelial cells cdna を secretion す る CHO cells - K1 を 単 from し, final に ECEcDNA を 単 from し た. The そ <s:1> results show that the molecular weight of the <s:1> protein part of ECE is approximately 80,000, the membrane penetration site is を1ケ そ ち, and the 亜 lead binding site is を and を. Neutral エ ン ド ペ プ チ タ ー ゼ と き わ め て tectonic の like た metal プ ロ テ ア ー ゼ で あ る こ と が わ か っ た. さ ら に C terminal side に 10 の グ リ コ シ レ ー シ ョ ン parts を hold つ こ と か ら, C terminal part を extracellular に hold ち, し た が つ て active site を extracellular に hold つ と exam え ら れ る. さ ら に こ の ECE は に bigET - 1 specific で あ る が, こ の he に ET - 3 に specific な ECE も exist す る こ と が わ か っ た.

项目成果

T.Enoki: "Long-lasting activation of cation current by endothelin-1 in smooth muscle cells of rabbit aorta and mouse fibroblasts." Brit.J.Pharmacol.(in press).

T.Enoki：“内皮素-1 在兔主动脉和小鼠成纤维细胞的平滑肌细胞中持久激活阳离子电流。”

T.Ikura: "cDNA cloning and expression of bovine endothelin converting enzyme" Biochem Biophys Res Commun. 203. 1417-1422 (1994)

T.Ikura：“牛内皮素转换酶的 cDNA 克隆和表达”Biochem Biophys Res Commun。

T.Masaki: "Ann.N.Y.Acad.Sci." Tne New York Academy of Sciences, 8 (1994)

T.Masaki：“Ann.N.Y.Acad.Sci”。

T.Shiraki: "Genetic transfer of endothelin converting enzyme activity to CHO-K1 cells:detection of positive cells by reverse hemolytic plaque assay." FEBS ;Letters. 351. 197-200 (1994)

T.Shiraki：“将内皮素转换酶活性基因转移至 CHO-K1 细胞：通过反向溶血斑测定检测阳性细胞。”

Y.Takagi: "Structural basis of G Protein specificity of human endothelin receptors:a study with endothelin A/B chimeras." J.Biol.Chem.(in press).

Y.Takagi：“人内皮素受体 G 蛋白特异性的结构基础：内皮素 A/B 嵌合体的研究。”