新しい内皮由来血管弛緩因子としてCNPの臨床的意義に関する分子生物学的研究

CNP作为新型内皮源性血管舒张因子临床意义的分子生物学研究

• 批准号: 06770805
• 负责人: 伊藤 裕
• 金额: $ 0.7万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06770805/
• 关键词: C型ナトリウム利尿プペチド; 血管内皮由来弛暖因子; サイクリックGMP; マイクロサテライト; モノクローナル抗体; ショック; 敗血症

ナトリウム利尿ペプチドファミリーは、ANP,BNP及びCNPより構成される。1992年、我々は、それまで神経ペプチドとしてのみ働くと考えられていたCNPが血管内皮細胞において生合成されることを明らかにし、CNPが一酸化窒素(NO)と並ぶプペチド性の血管内皮由来弛緩因子(EDRF)であることを発見した。今回、血管壁においてparacrine/autocrine regulatorとして働くと想定されるCNPの病態生理的意義について検討した。1.マウスCNP遺伝子クローニングと染色体位置の決定:マウスCNP遺伝子(約2.6kb)のクローニングに成功し、CNP遺伝子は少なくとも2つのエクソンと1つのイントロンから構成されていることが明らかとなった。マウスCNP遺伝子5'-隣接領域の近位部にはTATA box、cAMP応答因子様配列、SP1結合部位(GC box)、逆向きCCAAT配列(Y box)が認められ、その上流に25回のCA反復配列(マイクロサテライト)が認められた。PCR法による組換え近交系マウス間のマイクロサテライト多型の解析より、マウスCNP遺伝子は、Ren-1遺伝子と近接して第1染色体に存在することが明らかとなった。ANPとBNP遺伝子は、マウスでは第4染色体上に隣接して存在することが報告されており、神経ペプチドあるいはCNPは、心臓ホルモンであるANP及びBNPとは機能的にも遺伝子進化の上でも異なることが示唆された。2.抗CNPモノクローナル抗体の作成とそのRIA及び中和実験への応用:合成CNP-22をBALB/Cマウスに対し免疫投与し、CNPに対するモノクローナル抗体を得た。このモノクローナル抗体、KY-CNP-IはIgG_1サブクラスに属し、CNP対しKa=2.8×10^<10>M^<-1>と高い親和性を示した。KY-CNP-I用いたCNPに対するRIAの感度は、IC_<90>=1fmol/tube、IC_<50>=10fmol/tubeと高感度であった。更に、KY-CNP-Iは、CNPによる培養血管平滑筋細胞でのcGMP産生及びCNPの生体ラットへの静脈内投与による血中cGMP濃度の上昇を抑制した。3.ヒト及びラット血中におけるCNPの検出とショックにおけるCNPの臨床的意義の検討:健常人13名(64±14才)及び雄性ウィスター系ラット(250〜300g)より採血し、Sep-Pack C18カラムを用い血漿を抽出後、血中CNPの存在について検討した。ヒト及びラット血中にCNP様免疫活性を認めた(各々1.2±0.1fmol/ml及び2.4±0.4fmol/ml)。更に、CNPの強力な刺激因子であるTNF-αがその病態の中心をなすと考えられる敗血症患者で血中CNP濃度を測定したところ、12.3±2.9fmol/mlと有意に上昇し、更にショック患者(出血性、心原性、アナフィラキシ-)でも5.0±0.8fmol/mlと上昇を認め、これらの病態におけるプペチド性のEDRFと考えられるCNPの意義が示唆された。

The structure of ANP,BNP and CNP is very important. In 1992, CNP was synthesized in vascular endothelial cells by CNP, NO and EDRF. This paper discusses the significance of paracrine/autocrine regulator in vascular wall and its physiological changes. 1. The determination of chromosome position of CNP gene: CNP gene (about 2.6kb) was successfully transformed into CNP gene. CNP gene was transformed into CNP gene. The proximal part of the 5'-adjacent domain of the CNP gene is identified by TATA box, cAMP response factor alignment, SP1 binding site (GC box), reverse CCAAT alignment (Y box), and 25-loop CA repeat alignment (C box). PCR method is used to analyze the polymorphism between inbred lines, and the presence of Ren-1 gene and Ren-1 gene in the first chromosome. ANP and BNP genes are expressed on chromosome 4 adjacent to each other. 2. Preparation of anti-CNP antibodies for RIA and neutralization: synthesis of CNP-22 antibodies for BALB/C immunization, CNP antibodies for CNP The high affinity of KY-CNP-I to IgG_1 and CNP to Ka=2.8×10^<10>M <-1>was demonstrated. KY-CNP-I has high sensitivity, IC_<90>=1fmol/tube, IC_<50>=10fmol/tube. In addition, KY-CNP-I inhibited the production of cGMP in cultured vascular smooth muscle cells and the increase of cGMP concentration in blood after intravenous administration of CNP. 3. The clinical significance of CNP in blood samples was investigated in 13 healthy subjects (64±14 years old) and 13 male subjects (250 ~ 300g). The immune activity of CNP in blood was also detected in both Taitung and Taitung (1.2± 0.1 fmol/ml and 2.4± 0.4 fmol/ml respectively). In addition, CNP concentration in blood was measured in patients with hematological poisoning. CNP concentration increased intentionally from 12.3± 2.9 fmol/ml to 5.0± 0.8 fmol/ml.

项目成果

H.Itoh et al.: "Expression of Biologically active receptors for natriuretic peptides in the human uterine during pregnancy." Biochem.Biophys Res.Connun.203. 602-607 (1994)

H.Itoh 等人：“妊娠期间人类子宫中利钠肽生物活性受体的表达”。

Y.Ogawa et al.: "Molecular cloning,and chromosomal assignment of the mouse C-type natriuretic peptide (CNP) gene-Comparison with the human CNP gene-." Genomics. 24. 383-387 (1994)

Y.Okawa 等人：“小鼠 C 型钠尿肽 (CNP) 基因的分子克隆和染色体分配 - 与人类 CNP 基因的比较 -”。

Y.Ogawa et al.: "Molecular cloning of the complementary DNA and gene that encode mouse brain natriuretic peptide and generation of trausgenic mice that overexpress the brain natriuretic peptide gene." J.Clin.Invest.93. 1911-1921 (1994)

Y.Okawa 等人：“编码小鼠脑钠尿肽的互补 DNA 和基因的分子克隆，以及过度表达脑钠尿肽基因的创伤性小鼠的产生。”

I.Kishimoto et al.: "Natriuretic peptide clearance receptor is transcriptionally down-regulated by β2-adrenergic stimulation in vascular-smooth muscle cells." J.Biol.Chem.269. 28300-28308 (1994)

I.Kishimoto 等人：“血管平滑肌细胞中的 β2 肾上腺素刺激可转录下调利钠肽清除受体。”J.Biol.Chem.269（1994）。

N.Hama et al.: "A monoclonal antibody to C-type natriuretic peptide-Preparation and application to radioimmunoassay and neutralization experiment-." J.Endocrinol.141. 473-479 (1994)

N.Hama 等人：“C 型利钠肽单克隆抗体 - 制备及其在放射免疫测定和中和实验中的应用 -”。