網膜色素上皮細胞に対する網膜内在性増殖因子の解析

ウシ網膜(300眼)をホモジェナイズ後遠心し、その上清をウシ網膜抽出液として用いた。このウシ網膜抽出液には強い増殖活性があり、高濃度では胎生ニワトリ網膜色素細胞の形態変化を誘発する効果が認められた。増殖因子精製のために、これをまず硫安塩析にて粗分画・濃縮した。35-50%硫安分画を、分子ふるいクロマトグラフィー(Sephadex G-100)にて分画し、分子量約20kD〜65kDの大きさの物質を含む分画を次の段階に用いた。これを更に、DEAE-Sephadex A-25によるイオン交換クロマトグラフィー及びハイドロキシルアパタイトカラムクロマトグラフィーにて蛋白質の精製を試みた。前者にては約0.3〜0.5MNaClにて、後者は約0.4〜0.5MNaCl(pH7.40)にて溶出した分画に最も強い増殖活性が認められた。各段階にての増殖効果は、胎生6日目のニワトリ胚より得た網膜色素上皮細胞を培養し、対象細胞として判定した。順調に精製は進んだが、各段階におけるカラムへの吸着などによる因子量の減少や、その効果判定のために培養という長時間を要する手技を用いるために生ずる、経時的な増殖活性低下のために、これ以上の精製が困難となってしまった。現在、上記の4つの段階において、SDS-PAGEにて約10種類の蛋白質まで精製が行われている。その分子量は約15kD〜25kDであった。今後更なる精製を加えるためには、リソースカラムなどの中性条件下において高分離が可能な逆相高速液体クロマトグラフィーを用いる必要があると考えられる。

ウシ網膜(300眼)をホモジェナイズ後遠心し、その上清をウシ網膜抽出液として用いた。このウシ網膜抽出液には強い増殖活性があり、高濃度では胎生ニワトリ網膜色素細胞の形態変化を誘発する効果が認められた。増殖因子精製のために、これをまず硫安塩析にて粗分画・濃縮した。35-50%硫安分画を、分子ふるいクロマトグラフィー(Sephadex G-100)にて分画し、分子量約20kD〜65kDの大きさの物質を含む分画を次の段階に用いた。これを更に、DEAE-Sephadex A-25によるイオン交換クロマトグラフィー及びハイドロキシルアパタイトカラムクロマトグラフィーにて蛋白質の精製を試みた。前者にては約0.3〜0.5MNaClにて、後者は約0.4〜0.5MNaCl(pH7.40)にて溶出した分画に最も強い増殖活性が認められた。各段階にての増殖効果は、胎生6日目のニワトリ胚より得た網膜色素上皮細胞を培養し、対象細胞として判定した。順調に精製は進んだが、各段階におけるカラムへの吸着などによる因子量の減少や、その効果判定のために培養という長時間を要する手技を用いるために生ずる、経時的な増殖活性低下のために、これ以上の精製が困難となってしまった。現在、上記の4つの段階において、SDS-PAGEにて約10種類の蛋白質まで精製が行われている。その分子量は約15kD〜25kDであった。今後更なる精製を加えるためには、リソースカラムなどの中性条件下において高分離が可能な逆相高速液体クロマトグラフィーを用いる必要があると考えられる。