歯周病原性細菌のLPSによる破骨細胞前駆細胞内チロシンリン酸化反応

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歯周病原性細菌由来のLPSの細胞内シグナル伝達機構の解明を目的として、P.gingivalisよりLPSを調整し、LPS刺激による破骨細胞前駆細胞内チロシンリン酸化反応についてEscherichia coli.由来のLPSと比較検討を行った。実験方法として、まずP.gingivalis381株の凍結乾燥全菌体より、Hot phenol-water抽出法を用いてLPSを分離、精製した。対照として、E.coli A011株由来のLPSを用いた。つぎにヒト末梢血をPhycol-Hypaque液によりwhite cell fractionを分離し、20%horse serum含α-MEMにて2時間培養の後、非付着性細胞のみを分離、dexter cultureにて3週間培養し破骨細胞前駆細胞を得た。細胞内チロシンリン酸化反応の測定は、上記LPSによって刺激、誘導された破骨細胞前駆細胞を超音波破砕の後、超遠心にてmembrane画分およびcytosol画分を分離した。各サンプル中のチロシンリン酸化の検出は抗ホスホチロシン抗体を用いたウエスタンブロット法を用いて検出した。その結果、P.gingivalisのLPS刺激によって無刺激群と比較して有為に破骨細胞前駆細胞数が増加し、破骨細胞前駆細胞内チロシンリン酸化反応の検討の結果、41-kDaを含む種々の基質タンパク質が存在し、P.gingivalisのLPS刺激により特異的にチロシン残基がリン酸化されることが示唆された。本基質タンパク質は特にmembrane画分中に強く存在することが示唆された。一方、E.coli由来のLPS刺激群では、その発現がP.gingivalisのLPS刺激群よりも弱かった。本研究の結果から、P.gingivalisのLPS刺激によりヒト破骨細胞前駆細胞内で特異的にリン酸化される種々の基質タンパク質の存在が明らかになった。