ペプチドフラグメントを用いたリゾチーム構造形成初期過程の解析

点击翻译按钮获取中文摘要

リゾチームの構造形成初期過程の解析をペプチドフラグメントを用いて行った。まず、未修飾リゾチームを酸性条件下でブロモシアンを用いて、Met12とMet105の末側に切れ目を入れたものを調整した。次に、これをV8プロテアーゼ消化により2ヵ所のGlu(7位と35位)のC末側ペプチド結合を切断した。この反応物をゲルクロマトグラフィー及び逆相HPLCを用いて、リゾチームのフラグメント36-105を得た。このフラグメントの蛍光極大は、未修飾リゾチームと同一の340nmであった。また、円偏光二色性(CD)スペクトルを測定すると222nm付近に負の分子楕円率の極小をもつパターンを示し、ヘリックス構造の形成が示された。これらの結果から、このフラグメント内のTrp62またはTrp63が未修飾リゾチームのそれらと同様に溶媒から遮蔽された環境に位置することがわかった。また、このフラグメントに唯一存在するヘリックス88-98は構造を持っていることがわかった。つぎに、このフラグメントをアセチル化して、このヘリックスのC末側に位置するLys96及びLys97の電荷を同時に消失されたフラグメントを調製した。このアセチル化フラグメントにおいて、蛍光極大は354nmまでシフトし、2つのTrp残基は溶媒に露出したことがわかった。一方、CDスペクトルより、ヘリックス構造は消失したことがわかった。ヘリックスC末側に位置する正電荷を消失させ、電荷一ヘリックスダイポール相互作用によるヘリックスの安定性を低下させることにより、Trp残基が溶媒に露出したことから、ヘリックス88-98とTrp62または、Trp63はフラグメント36-105において、相互作用していると結論した。このフラグメント領域は、リゾチームの構造形成初期段階で形成される領域であることから、フラグメントにおける相互作用は、構造形成初期段階で起こっていることが強く示唆された。