組換えTSHレセプター発現細胞を用いた自己免疫性甲状腺疾患の病態解析

使用重组 TSH 受体表达细胞对自身免疫性甲状腺疾病进行病理学分析

• 批准号: 06772219
• 负责人: 乾 武広
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Shiga University of Medical Science
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06772219/
• 关键词: TSHレセプター; TSHレセプター抗体; 甲状腺刺激性抗体; 阻害性TSH受容体抗体

TSHやTSHレセプター(R)抗体の甲状腺への作用機序はTSHRへの結合により惹起すると推定されている。λgt-11ファージをヒトTSHRcDNA(細胞外領域を150残基ずつ3部分(13〜168残基、159〜308残基、299〜448残基)を組み込んだのち、大腸菌に感染させ、βガラクトシダーゼとの融合蛋白としてTSHR部分を作成し、標識TSHとの結合からTSHRのN端にTSHが結合することを報告した。ヒトTSHRcDNAをCHO細胞に発現させるためpCDNeo-TSHRを培養した。CHO細胞にエレクトロポレーション法、または燐酸カルシウム法にてTSHRを導入した。^<125>I-標識TSHは特異的な結合性を示し、この結合はTSAb(甲状腺刺激抗体)もTSBAb(阻害性TSH受容体抗体)でも抑制することを見出した。ブタ甲状腺細胞膜を用いる市販のTSHRアッセイ法でのTSAbやTSBAbのTBI(TSH結合抑制)活性とTSHR導入CHO細胞法でのTBI活性はある程度の相関を示した。また、TSHR導入細胞膜でのTSHRアッセイ法では標識TSHの結合はTSHR導入細胞の場合よりも低下した。ヒトTSHRcDNA(Bluescriptに入っている)を制限酵素(Bam H_1およびEcoRI)で切断し、maltose-binding protein(MBP)発現ベクター(p-MAL-p_2 vector)を挿入した。大腸菌にてMBPとTSHR蛋白を融合蛋白として生成したのち、アミローズ結合カラムにてこの融合蛋白を精製した。酵素(FactorXa)でMBPとTSHR蛋白を切断したのち、再びアミロ-ゼ結合カラムにてTSHR蛋白を単離精製した。^<125>I-標識TSHの結合性を検討したところ、弱い結合活性を見出した。また、この結合はTSAbやTSBAbでも抑制されることを見出した。しかし、本法での単離TSHR蛋白は少量であり、これは分子量が8万程度のため、大腸菌内での蛋白合成が起こりにくいためと思われた。そこで、ヒトTSHRの細胞外領域(418ヶのアミノ酸)のみの蛋白合成を以下の方法で検討中である。ヒトTSHRcDNAの細胞外領域のprimerを用いてPCRでヒトTSHR細胞外領域cDNAを合成し、発現ベクターに挿入したのち大腸菌にMBP融合蛋白を生成する。MBPを酵素で切断し、TSHR細胞外領域を単離精製したのち、この蛋白に対する抗体(ポリクロナールおよびモノクロナール抗体)を作成し、TSHR細胞外領域抗体の^<125>I-標識TSHのレセプターへの結合阻止能およびcAMP生成反応を検討中である。

The mechanism of action of TSH and TSH receptor (R) antibodies in thyroid gland is presumed to be due to the binding of TSHR receptor. TSHR cDNA (extracellular domain, residues 150, residues 13 ~ 168, residues 159 ~ 308, residues 299 ~ 448) is composed of three parts, Escherichia coli infection, β-glucuronidase fusion protein and TSHR part, identification of TSH binding, TSH binding at the N-terminal of TSHR. TSHR cDNA was developed in CHO cells and pCDNeo-TSHR was cultured. CHO cells were introduced into TSHR by the reverse transcription method and the reverse transcription method. <125>I-TSH specific binding is shown, and binding to TSAb(thyroid stimulating antibody) and TSBAb(TSH inhibiting receptor antibody) is shown. Correlation between TSAb, TSBAb and TBI(TSH binding inhibition) activity in thyroid cell membrane by TSHR assay and TBI activity by TSHR introduction into CHO cells. The TSHR assay was used to identify TSH binding to TSHR-introduced cells. TSHR cDNA (Bluescript entry) is a restriction enzyme (Bam H_1 and EcoRI) that cleaves and maltose-binding protein(MBP) and produces a protein (p-MAL-p_2 vector). E. coli MBP and TSHR fusion proteins were produced and purified. Enzyme (FactorXa): MBP and TSHR protein are cut off and purified. <125>I-labeled TSH binding activity was detected. TSAb, TSBAb, TSAb, TSBAb, TSAb, TSAb, TSBAb, TSAb, TSBAb, TSBAb, TSBAb The protein synthesis in E. coli was initiated in small amounts. The following methods for protein synthesis in the extracellular domain of TSHR are discussed. TSHR cDNA extracellular domain primer was synthesized by PCR, and MBP fusion protein was generated by PCR. MBP enzyme cleavage, TSHR extracellular domain isolation purification, protein specific antibodies (antibodies) production, TSHR extracellular domain antibodies <125>I-labeled TSH binding inhibition and cAMP production are discussed.

项目成果

越智 幸男: "甲状腺自己抗体" Medical Practice. 11. 1393-1398 (1994)

Yukio Ochi：“甲状腺自身抗体”医学实践 11. 1393-1398 (1994)。

Chen Wen: "Studies on the action of thyroid stimulation blocking antibody(TSBAb)on thyroid thyroid cell membrane" Thyroid. 4. 479-483 (1994)

陈文：“甲状腺刺激阻断抗体（TSBAb）对甲状腺细胞膜作用的研究” 甲状腺。

Inui Takehiro: "Production of thyroid stimulation bloking antibody without TSH receptor binding activity in rabbits with experimental autoimmune thyroiditis" Hormone and Metabolic Research. 26. 5-8 (1994)

Inui Takehiro：“在患有实验性自身免疫性甲状腺炎的兔子中生产无 TSH 受体结合活性的甲状腺刺激阻断抗体”激素和代谢研究。