組換えTSHレセプター発現細胞を用いた自己免疫性甲状腺疾患の病態解析

使用重组 TSH 受体表达细胞对自身免疫性甲状腺疾病进行病理学分析

• 批准号: 07772255
• 负责人: 乾 武広
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Shiga University of Medical Science
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07772255/
• 关键词: TSHレセプター; TSHレセプター抗体; 甲状腺刺激性抗体; 阻害性TSH受容体抗体

(1)TSHレセプター抗体(TRAb)のTSHレセプター(R)の結合特異性とTRAbの生物活性発現部位とのヒトTSHRcDNAをpCDNeo‐TSHR(TSHRcDNAを挿入した動物細胞発現用プラスミドneomysin耐性遺伝子を有する)をCHO細胞にエレクトロポレーション法にて導入した。このCHO細胞膜を用いて^<125>I‐標識bTSHの結合を検討したところ、天然のブタ甲状腺細胞膜(可溶化または非可溶化)を用いた場合と同じような特異的結合を示した。bTSHによる^<125>I‐標識bTSHの結合抑制TBI(TSH結合抑制)活性のIC_<50>(TBI50%を示す活性)はCHO細胞膜の方がブタ甲状腺細胞膜よりも少量であった。多量のbTSHのTBI活性は、CHO細胞膜では80%であり、ブタ甲状腺細胞膜では90%であった。このTSHRアッセイ法で、甲状腺機能亢進症患者血清中のTSAbと甲状腺機能低下症患者血清中のTSBAbのTBI活性を測定した。CHO細胞膜でのTBI活性はTSAbとTSBAbともブタ甲状腺細胞膜を用いた場合よりも有意に低値(50%程度)であった。これらの実験から、これら両TRAbはヒト甲状腺細胞膜よりもブタ甲状腺細胞膜に特異的に結合することが示唆された。組換えヒトTSHRではなく、ヒト甲状腺細胞膜(正常またはバセドウ病甲状腺細胞膜)を用いたTSHRアッセイ法でもブタ甲状腺細胞膜よりもTRAbのTBI活性は低値であったので、TRAbはヒトTSHRを用いるアッセイ法はブタTSHよりも感度が劣ることが推定された。(2)TSAb‐IgGをパパイン(システイン存在下)やペプシンで加水分解したのちProtein A‐Sepharoseカラムで未吸着と吸着分画に分け、Sephadex G‐100でゲル濾過した。Protein A未吸着分画の甲状腺刺激活性はFab(50KD)とそれに続くretarded分画(50KD以下の小分子)に認められた。また、Protein A吸着分画の甲状腺刺激活性は、未消化のIgG分画とそれに続くFc分画(主にFcであるがFabの混入がある)と、さらにretarded分画(50KD以下の小分子)に認められた。このFc分画の甲状腺刺激活性は、Anti‐ヒトFab‐Sepharoseのアフィニティークロマト法で未吸着分画(Fc)に認められないが、吸着分画(Fab分画)に認められる。この実験から、TSAb‐IgGの甲状腺刺激活性は、FabおよびFabよりも小分子分画(Fabの分解物によるらしい)に見出された。このFab分画は、TBI活性は強陽性であるが、小分子分画は非常に弱かった。まとめ組換えヒトTSHRでTRAb測定は可能であったが、TBI活性はブタ甲状腺細胞膜(ブタTSHR)よりも感度が低い。TSAb‐IgGのプロテアーゼ処理により、Fab分画のみならず、より小さい小分子分画にTSHRの結合活性と甲状腺刺激活性が見出された。

(1) Binding specificity of TSH antibody (TRAb) and bioactive site of TSH antibody (R) and TSHRcDNA pCDNeo-T SHR(TSHRcDNA) is inserted into animal cells and is currently used in neomysi n Resistance leftovers have been introduced into CHO cells using the same method.このCHO cell membrane is marked with いて^<125>I-marked bTSH binding を検検したところ、natural のThe thyroid cell membrane (soluble and non-solubilized) can be used in various situations to specifically bind to thyroxine. bTSH による^<125>I-marks bTSH binding inhibition TBI (TSH binding inhibition) activity IC_<50> (TBI50% shows activity) and CHO cell membrane の方がブタ thyroid cell membrane よりもa small amount of であった. A large amount of bTSH has TBI activity, 80% of the CHO cell membrane is active, and 90% of the thyroid cell membrane is active. The TSHR method was used to measure the activity of TSAb in the serum of patients with hyperthyroidism and the activity of TBI in the serum of patients with hypothyroidism. The TBI activity of CHO cell membranes and TBSAb and thyroid cell membranes are intentionally low (50% level) when used.これらの実験から、これら両TRAbはヒトthyroid cell membrane よりもブタ thyroid cell membraneにspecific binding することがshows 膆された. Replacement of thyroid cell membrane with TSHR and thyroid cell membrane (normal thyroid cell membrane with disease) and thyroid cell membrane with TSHR method of thyroid cell membraneりもTRAb's TBI activity is low, TRAb's TSH is low R is estimated using the TSH sensitivity method using the TSH method. (2) TSAb-IgG をパパイン (in the presence of システイン) やペプシンで hydrolyzable したのちProtein A-Sepharose カラムで unadsorbed and adsorbed に分け, Sephadex G-100 filter filter. Protein A has not been adsorbed and divided into thyroid stimulating activity Fab (50KD) and retarded (small molecules below 50KD).また、Protein A: Adsorption and thyroid stimulating activity, undigested IgG and Fc (main) Fabのmixed with がある)と, さらにretarded drawing (small molecules below 50KD) められた.このFc分画のthyroid stimulating activityは、Anti-ヒトFab-Sepharoseのアフィニティークロマト法で不sorbed separation (Fc)にcognitionめられないが, absorption separation (Fab separation)にcognitionめれる.この娓から, TSAb-IgGのthyroid stimulating activityは, FabおよびFabよりもsmall molecule separation (Fabのdegradation productによるらしい)に见出された. The Fab is divided into two types, the TBI activity is strong and positive, and the small molecule type is very weak and weak. It is possible to measure the TSHR and TRAb by group replacement, and the TBI activity and thyroid cell membrane (TSHR) of the TBI are low in sensitivity. TSAb-IgG のプロテアーゼtreatment により, Fab characterization のみならず, より小さいsmall molecule characterization TSHR のbinding activity and thyroid stimulating activity が见出された.