組換えTSHレセプター発現細胞を用いた自己免疫性甲状腺疾患の病態解析

使用重组 TSH 受体表达细胞对自身免疫性甲状腺疾病进行病理学分析

• 批准号: 07772255
• 负责人: 乾 武広
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Shiga University of Medical Science
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07772255/
• 关键词: TSHレセプター; TSHレセプター抗体; 甲状腺刺激性抗体; 阻害性TSH受容体抗体

(1)TSHレセプター抗体(TRAb)のTSHレセプター(R)の結合特異性とTRAbの生物活性発現部位とのヒトTSHRcDNAをpCDNeo‐TSHR(TSHRcDNAを挿入した動物細胞発現用プラスミドneomysin耐性遺伝子を有する)をCHO細胞にエレクトロポレーション法にて導入した。このCHO細胞膜を用いて^<125>I‐標識bTSHの結合を検討したところ、天然のブタ甲状腺細胞膜(可溶化または非可溶化)を用いた場合と同じような特異的結合を示した。bTSHによる^<125>I‐標識bTSHの結合抑制TBI(TSH結合抑制)活性のIC_<50>(TBI50%を示す活性)はCHO細胞膜の方がブタ甲状腺細胞膜よりも少量であった。多量のbTSHのTBI活性は、CHO細胞膜では80%であり、ブタ甲状腺細胞膜では90%であった。このTSHRアッセイ法で、甲状腺機能亢進症患者血清中のTSAbと甲状腺機能低下症患者血清中のTSBAbのTBI活性を測定した。CHO細胞膜でのTBI活性はTSAbとTSBAbともブタ甲状腺細胞膜を用いた場合よりも有意に低値(50%程度)であった。これらの実験から、これら両TRAbはヒト甲状腺細胞膜よりもブタ甲状腺細胞膜に特異的に結合することが示唆された。組換えヒトTSHRではなく、ヒト甲状腺細胞膜(正常またはバセドウ病甲状腺細胞膜)を用いたTSHRアッセイ法でもブタ甲状腺細胞膜よりもTRAbのTBI活性は低値であったので、TRAbはヒトTSHRを用いるアッセイ法はブタTSHよりも感度が劣ることが推定された。(2)TSAb‐IgGをパパイン(システイン存在下)やペプシンで加水分解したのちProtein A‐Sepharoseカラムで未吸着と吸着分画に分け、Sephadex G‐100でゲル濾過した。Protein A未吸着分画の甲状腺刺激活性はFab(50KD)とそれに続くretarded分画(50KD以下の小分子)に認められた。また、Protein A吸着分画の甲状腺刺激活性は、未消化のIgG分画とそれに続くFc分画(主にFcであるがFabの混入がある)と、さらにretarded分画(50KD以下の小分子)に認められた。このFc分画の甲状腺刺激活性は、Anti‐ヒトFab‐Sepharoseのアフィニティークロマト法で未吸着分画(Fc)に認められないが、吸着分画(Fab分画)に認められる。この実験から、TSAb‐IgGの甲状腺刺激活性は、FabおよびFabよりも小分子分画(Fabの分解物によるらしい)に見出された。このFab分画は、TBI活性は強陽性であるが、小分子分画は非常に弱かった。まとめ組換えヒトTSHRでTRAb測定は可能であったが、TBI活性はブタ甲状腺細胞膜(ブタTSHR)よりも感度が低い。TSAb‐IgGのプロテアーゼ処理により、Fab分画のみならず、より小さい小分子分画にTSHRの結合活性と甲状腺刺激活性が見出された。

(1) The binding specificity of TSH receptor (R) of TSH receptor antibody (TRAb), the bioactive site of TRAb, and the expression site of TSHR cDNA were introduced into CHO cells by pCDNeo-TSHR(TSHR cDNA was introduced into CHO cells for the development of neomysin resistant gene). The CHO cell membrane is <125>used to identify bTSH binding. The natural thyroid cell membrane (solubilized or not solubilized) is used to identify bTSH binding. bTSH <125>binding inhibition IC_ (TBI 50% activity) of bTSH binding inhibition IC_<50>(TBI 50% activity) of CHO cell membrane TBI activity of CHO cell membrane is 80%, thyroid cell membrane is 90%. TSAb and TBI activity in serum of patients with hyperthyroidism and hypothyroidism were measured by TSHR assay. CHO cell membrane TBI activity is intentionally low (50%) This is the first time I've ever seen a thyroid cell membrane. The TBI activity of TRAb in thyroid cell membrane (normal or diseased thyroid cell membrane) was estimated to be low by TSHR method. (2)TSAb-IgG is decomposed by water and purified by Sephadex G-100. Protein A unadsorbed fraction thyroid stimulating activity Fab(50KD) and Retarded fraction (50KD or less) Protein A uptake assay thyroid stimulating activity undigested IgG assay undigested Fc assay undigested Fc assay undigested Fab assay undigested Fc undigested Thyroid stimulating activity of Fc assay, Anti-Fab-Sepharose assay, unsorbed assay (Fc), sorbed assay (Fab assay) The thyroid stimulating activity of TSAb-IgG is shown in Fab and Fab fragments. Fab, TBI activity is strong, small molecule is weak. TBI activity is low in thyroid cell membrane (TSHR). The binding activity and thyroid stimulating activity of TSAb-IgG were observed in the treatment, Fab fractionation and small molecule fractionation.