RT-PCR法によるネフローゼ自然発症マウス腎糸球体内の遺伝子発現の解析

ICGNマウスは、近年見いだされたネフローゼ症候群を伴う糸球体腎炎を自然発症するマウスで、末期には重度の糸球体硬化症に陥る。一般に、腎における血漿蛋白の濾過障壁は、腎糸球体基底膜であると考えられている。糸球体基底膜は、IV型コラーゲンによる基本骨格に、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチンなどが結合したものである。また、糸球体硬化症の発症および進行には、TGF-βおよびPDGFが深く関与すると考えられている。従って、ICGNマウスではこれらの構成成分の遺伝子発現に何らかの異常があると考えられる。そこで、本研究では、蛋白濾出および糸球体硬化症の発症機序を分子遺伝学的に明らかにするため、糸球体局所でのこれらの遺伝子の発現を解析する。糸球体局所で遺伝子発現を調べるためには、糸球体を単離する必要があったため、マイクロディセクション法による腎糸球体単離の方法を確立した。つぎに、30個の糸球体から全RNAを抽出し、RT反応を行う系を確立した。IV型コラーゲンα鎖、ラミニン、TGF-βおよびRT-RCRにおいて定量的分析を行う際のコントロールとして使用するベータアクチンについて、それぞれ1セットのプライマーを合成した。これらのプライマーと糸球体から調整したcDNAを用いてPCRを行い、単一のDNA断片が合成される条件を決定した。さらに、PCR産物のデンシトメトリーによる定量法を確立した。これにより、RT-RCRによる腎糸球体局所での遺伝子発現を定量とすることが可能となった。この方法で、生後3週目のICGNマウスとICRマウスの腎糸球体におけるIV型コラーゲンα鎖のmRNA量を比較したところ、発現量はICGNマウスのほうが有為に増加していた。現在、他の遺伝子についておよびそれらの経時的変化について検討中である。

ICGNマウスは、近年見いだされたネフローゼ症候群を伴う糸球体腎炎を自然発症するマウスで、末期には重度の糸球体硬化症に陥る。一般に、腎における血漿蛋白の濾過障壁は、腎糸球体基底膜であると考えられている。糸球体基底膜は、IV型コラーゲンによる基本骨格に、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチンなどが結合したものである。また、糸球体硬化症の発症および進行には、TGF-βおよびPDGFが深く関与すると考えられている。従って、ICGNマウスではこれらの構成成分の遺伝子発現に何らかの異常があると考えられる。そこで、本研究では、蛋白濾出および糸球体硬化症の発症機序を分子遺伝学的に明らかにするため、糸球体局所でのこれらの遺伝子の発現を解析する。糸球体局所で遺伝子発現を調べるためには、糸球体を単離する必要があったため、マイクロディセクション法による腎糸球体単離の方法を確立した。つぎに、30個の糸球体から全RNAを抽出し、RT反応を行う系を確立した。IV型コラーゲンα鎖、ラミニン、TGF-βおよびRT-RCRにおいて定量的分析を行う際のコントロールとして使用するベータアクチンについて、それぞれ1セットのプライマーを合成した。これらのプライマーと糸球体から調整したcDNAを用いてPCRを行い、単一のDNA断片が合成される条件を決定した。さらに、PCR産物のデンシトメトリーによる定量法を確立した。これにより、RT-RCRによる腎糸球体局所での遺伝子発現を定量とすることが可能となった。この方法で、生後3週目のICGNマウスとICRマウスの腎糸球体におけるIV型コラーゲンα鎖のmRNA量を比較したところ、発現量はICGNマウスのほうが有為に増加していた。現在、他の遺伝子についておよびそれらの経時的変化について検討中である。