PCR-SSCP法を用いた水中細菌の高速同時検出方法の開発

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本研究の目的に合致した標的領域(プライマー配列部分は細菌に共通で,その間の増幅領域の配列が異なるDNA領域)をデータベース検索等により調査し,選択した。本研究では16SリボソームRNAの大腸菌を基準としたポジションの1101〜1407の間を増幅するプライマーを合成して使用した。複数の細菌種について選択領域をPCRで増幅し,増幅産物のSSCP法による解析を行い,有効性を実験的に確認しようと試みた。キャピラリー電気泳動装置を用いてSSCP法を行ったが,増幅産物の分離は行った実験条件下ではできず,失敗に終わった。環境試料についてPCR法を適用し,その有効性を確認するために,環境試料中の成分による妨害について検討した。フミン酸は試験した0.5〜1000mg/Lの全範囲で反応を阻害した。硫酸マンガン(II)は試験した0.05〜1000mgMn/Lの範囲では反応を阻害しなかった。硫酸アルミニウムは5〜10mgAl/Lで、鉄は0.5〜1.0mgFe/Lで,ベントナイトは1〜5mg/L,また,カオリンは10〜100mg/Lの間でPCRの阻害が生じ,これらの濃度を越えると増幅は十分に行われなず,増幅DNAのバンドは肉眼では全く観察されなくなった。粘土鉱物(カオリン及びベントナイト)によるPCR阻害は,吸着などの固形粒子が存在することによる影響なのか,粘土鉱物の構成成分が溶解して阻害作用を示すのかといった理由は現在のところ不明である。フミン質によるPCRの阻害は環境水について既に幾つかの報告例がある。本研究でもこれらと同様にフミン酸による強いPCR阻害がみられた。金属塩によるPCR阻害はpH変化が関与している可能性もあり,今後の検討が必要である。