AP-PCR-SSCPを用いた病態特異的な遺伝子多型の網羅的探索法の確立と応用

AP-PCR-SSCP疾病特异性基因多态性综合检索方法的建立及应用

基本信息

批准号：
15659133
负责人：
前川真人
金额：
$ 2.24万
依托单位：
Hamamatsu University School of Medicine
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15659133/
关键词：
AP-PCR SSCP SNPs 遺伝子多型テイラーメイド医療 SSCO

项目摘要

特定の病態などの表現型に関連している遺伝子多型を直接検出する方法として、SNPから表現型へ進むのではなく、特定の表現型を説明できる遺伝型を探索するという逆のプロセスをたどるための基本的手法として、AP-PCR (arbitrary primed PCR)-SSCP (single strand conformation polymorphism)を利用した。1)長寿者とそれ以外のDNAを混合したDNAプールを作成する。100歳以上の百寿者1グループ(9人)、90歳3グループ(8本ずつ)、60歳1グループ(10人)から抽出したgenomic DNAをプールした。2)13種類のプライマーでAP-PCR (arbitrary primed PCR)を施行した.アガロースゲルで増幅産物を確認後、10%PAG、15℃、3.5時間のSSCP泳動を行った.銀染色による可視化で、表現型によって移動度の異なるバンド、濃さが変化しているバンドを切り出し、再PCRの後、TAクローニングを行い、ベクタープライマーで塩基配列を決定した。3)BLAST検索により得られた塩基配列から該当する遺伝子を同定した。4)遺伝子特異プライマーを用いて各表現型の個体それぞれをPCR-SSCP法で解析し、表現型と遺伝型との関連性について検証した。また、塩基配列決定によりSNPを同定した。その結果判明したSNPのうち、高齢者に高頻度に見いだされたSNPを1つ同定した。高齢者の例数も少なかったことから、医学部学生をコントロールとして分析し、SNPの頻度を比較したところ、Homosapiens 3 BAC RP11-61K12 (AC130566)の8768C>G polymorphismが見いだされた.この方法の考え方は、絨毯爆撃的にSNPを検出してから意味付けするのではなく、まとまったポピュレーションを説明できるSNPを探していこうというものである。方法として用いたAP-PCR-SSCPは、網羅的な遺伝子増幅プラスSSCPによる一本鎖としての分離と定量性である。今後、本法をさらにブラッシュアップして、プロテオミクス解析で用いられている2次元電気泳動と蛍光標識プライマーによる遺伝子増幅を組み合わせると、より詳細な解析が可能と考える.

我们使用AP-PCR（任意Primed PCR）-SSCP（单链构象多态性）作为一种基本方法，用于直接检测与表型相关的遗传多态性，例如特定病理学，而不是从SNP到表型，以搜索可以解释特定表型的基因型。 1）创建一个DNA池，将长寿人与其他DNA混合在一起。基因组DNA从一组100个或以上（9人），90岁（每人8瓶）和60岁（10岁）的一组（10人）中提取。 2）用13种引物进行AP-PCR（任意Primed PCR）。确认琼脂糖凝胶上的扩增产物后，SSCP在15°C的10％PAG下运行3.5小时。用银色染色带有不同迁移率和具有不同强度的带的银染色带的可视化，并根据表型，然后使用ta克隆，并使用矢量引物确定基本序列。 3）从通过BLAST搜索获得的核苷酸序列中鉴定出相关基因。 4）使用PCR-SSCP方法使用基因特异性引物分析了每种表型的个体，以验证表型与基因型之间的关系。另外，通过碱基测序鉴定了SNP。在发现的SNP中，在老年人中经常发现一个SNP。由于老年人的病例数量少，分析了医学生作为对照并比较了SNP的频率，并在同妇中发现了8768c> g多态性3 BAC RP11-61K12（AC130566）。这种方法的想法是可以发现SNP可以解释一个可以解释凝聚人群的人群，而不是凝聚的人群，然后将拼接式轰炸探测出来。用作方法的AP-PCR-SSCP是全面的基因扩增以及SSCP的单链分离和定量性。将来，我们认为，通过将蛋白质组学分析中使用的二维电泳与使用荧光标记的引物相结合的基因扩增，将进行更详细的分析。

项目成果

期刊论文数量（22）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

遺伝子検査をとりまく環境と現状・将来

基因检测环境、现状与未来

DOI：
发表时间：
2003
期刊：
日本臨床検査自動化学会会誌 28(5)
影响因子：
0
作者：
Miyakura Y;Sugano K;Akasu T;Yoshida T;Maekawa M;Saitoh S;Sasaki H;Nomizu T;Konishi F;前川真人;前川真人
通讯作者：
前川真人

Problem with Detection of an Insertion-Type Mutation in the BCHE Gene in a Patient with Butyrylcholinesterase Deficiency.

丁酰胆碱酯酶缺陷患者 BCHE 基因插入型突变检测的问题。

DOI：
发表时间：
2004
期刊：
Clin Chem 50
影响因子：
0
作者：
Maekawa M;Taniguchi T;Ishikawa J;Toyoda S;Takahata N
通讯作者：
Takahata N

原発不明癌

原发性不明的癌症

DOI：
发表时间：
2005
期刊：
日本分子腫瘍マーカー研究会誌 20(in press)
影响因子：
0
作者：
Maekawa M;Taniguchi T;Uramoto T;Higashi H;Horii T;Takeshita A;Sugimura H;Kanamori M;前川真人;前川真人
通讯作者：
前川真人

遺伝子診断

基因诊断

DOI：
发表时间：
2009
期刊：
呼吸と循環 57
影响因子：
0
作者：
Kamogawa S;Kagami K;Maeda M;Arai K;Okubo Y;Tsuboi R;Hirano T;Setoguchi Y;Sriwiriyanont P;Hachiya A;Hachiya A;Ramogawa S;Ookubo M;瀬戸口靖弘
通讯作者：
瀬戸口靖弘

膵癌の腫瘍マーカー

胰腺癌的肿瘤标志物