均一化cDNAライブラリーを用いた植物生長点分化に関与する遺伝子の単離と解析

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植物の発生および形態形成のプログラムは、生長点の分化により決定される。本研究では、遺伝子発現分布の解析技法により茎頂分裂組織の分化に関与する遺伝子を単離することを目的とした。これまでに組織特異性に基づいて単離された遺伝子は、いずれも多量に存在し、分化の方向を決定する遺伝子というより、その結果により発現の誘導されたものであった。そこで均一化cDNAライブラリーを構築し遺伝子の単離に利用することにした。栄養生長期のアラビドプシス地上部組織由来のcDNA(Vegetative Straight:VS)を合成し、均一化操作を加え、各均一化cDNA(Vegetative Equalized:VE)ライブラリーを作成した。コロニーハイブリダイゼーションおよびランダムな塩基配列の決定によりライブラリーの均一化度を評価、ほぼ均一化している事を確認した。同様に、実体顕微鏡下で採取した第5ステージまでの花序・花分裂組織(約2000個)由来のcDNA(Inflorescence Straight:IS)を合成し、均一化操作を加え、各均一化cDNA(Inflorescence Equalized:IE)ライブラリーを作成した。約10000クローンを規則正しく保存しVS、VE、ISのDNAをプローブにしたディファレンシャルハイブリダイゼーションを行い、各々、栄養生長期に大量に発現するもの、微量ではあるが栄養生長期にも発現しているもの、花序で大量に発現しているものを同定し、これらを除いた。すなわち、花序分裂組織特異的に比較的少量発現する遺伝子を選抜した結果、約400クローンが得られた。一部については、塩基配列の決定ならびにノザン法により特異的発現の確認を行った。ノザン法のレベルで花序・花分裂組織特異的に発現する遺伝子について、今後、発現する細胞の特定、形質転換体での機能解析が必要である。