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血管内皮細胞におけるプロスタサイクリン産生調節機構の解析

血管内皮细胞产生前列环素的调控机制分析

基本信息

批准号：
06770096
负责人：
原俊太郎
金额：
$ 0.58万
依托单位：
National Cardiovascular Center Research Institute
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

精製したウシプロスタサイクリン合成酵素の部分アミノ酸配列より混合プライマーを設計し、PCR法によりウシ血管内皮細胞mRNAを鋳型として用い、まず、ウシプロスタサイクリン合成酵素cDNA断片を単離した。このcDNA断片の塩基配列をもとにプライマーを合成し、5′-RACE法および3′-RACE法によりウシプロスタサイクリン合成酵素の全長をコードするcDNAを得た。また、得られたcDNA断片をプローブに用い、PCR法およびプラークハイブリダイゼーション法によりヒトプロスタサイクリン合成酵素cDNAの単離にも成功した。得られたcDNAを発現ベクターSRαに組み込み、COS細胞にトランスフェクトしたところ、トランスフェクトした細胞ミクロソームに酵素活性が発現することが確認された。また、ジデオキシ法により得られたcDNAの塩基配列を決定し、その配列より本酵素の全アミノ酸配列を決定した。その結果、ウシ酵素、ヒト酵素ともに500個のアミノ酸よりなるタンパクであること、また、プロスタサイクリン合成酵素がチトクロームP-450の中で既知のものと異なる新しいファミリーを形成することがわかった。さらに、得られたcDNAを用い、RNAブロット解析を行った。その結果、プロスタサイクリン合成酵素が心臓や肺をはじめとし、幅広い組織において発現していることがわかった。また、ウシやヒトの培養血管内皮細胞を腫瘍壊死因子(TNF)などの炎症性サイトカインで刺激すると、プロスタサイクリン合成酵素mRNA発現の上昇が観察された。

Some of the synthetic enzymes were isolated from the mRNA fragments of vascular endothelial cells by PCR method. On the basis of cDNA fragments, the whole length of synthetic enzymes was determined by 5'-RACE method, 5'-RACE method, 3'-RACE method and cDNA method. The cDNA fragments were obtained and the PCR method was used. The synthetic enzyme cDNA was isolated from the enzyme successfully. The expression of SR α was detected by cDNA, the activity of enzyme was detected by enzyme activity, and the activity of enzyme was confirmed by COS. In this way, we can get the basic column "determination", "determination", "total enzyme", "acid column", "determination", "cDNA", "determination", "determination". The results, enzyme, enzyme If you want to cDNA, you will need to use RNA to parse the line. The results showed that the synthetic enzymes were detected in the lungs and lungs, and the tissue structure was detected. Vascular endothelial cell death factor (TNF) was isolated from vascular endothelium. Inflammatory cytokine was used to stimulate the endothelium. The synthetic enzyme mRNA was detected.