リバースジェネティクスによるパラミクソウイルスのRNA-editing機構の解析

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本研究においては、ネガティブストランドRNAウイルスにおけるリバースジェネティクスの確立とともに、PIV-2の転写及びRNA-editing機構の解析を、ポリメラーゼの供給源として、ヘルパーウイルス系と組み換え体ワクシニアウイルスT7発現系の2つの方法を用いて行った。(1)ヘルパーウイスル系-T7ポリメラーゼを用いてin vitroで合成したPIV-2ゲノム様のミニゲノムRNAを各種細胞(HeLa,Vero,MDCK,Cop5)に種々の方法(リポフェクチン法、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法)を用いてトランスフェクトして、そのミニゲノムからの転写産物である蛋白を抗MuV-NP抗体で蛍光抗体法により同定しようと試みたが、このいずれの組み合わせでも高効率での発現及び再現性はなかった。また、トランスフェクトするミニゲノムRNA濃度等の条件検討、さらに、R.R.lysateを使ったRNP複合体の再構成産物による実験も行ったが結果は変わらなかった。このヘルパーウイスル系での実験では、細胞約5万個に1個制度ミニゲノム転写産物の発現が認められた。この要因はRNAのトランスフェクト効率の悪さに起因しているものと思われる。(2)組み換え体ワクシニアウイルスT7発現系-種々の条件検討により、ワクシニアウイルスのm.o.i.を2とし、PIV-2ポリメラーゼ複合体を形成するNP,P,L蛋白のcDNA量をそれぞれ2,2,1μgとして、Earlで切断したミニゲノムcDNA(2μg)とともにワクシニアウイルス感染細胞にリポフェクチンを用いてトランスフェクトした。その結果、ミニゲノムからの本来の転写産物とともにRNA-editingによりできたと考えられる蛋白がウエスタンブロットで検出された。