破骨細胞におけるColony Stimulating Factor-1レセプターの発現と制御に関する研究

破骨细胞集落刺激因子1受体表达及调控研究

基本信息

批准号：
07771672
负责人：
天野均
金额：
$ 0.51万
依托单位：
Showa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07771672/
关键词：
破骨細胞 CSF-1 レセプター c-fms Down-regulation cycloheximide サイトカイン tyrosine kinase

项目摘要

Chambersらの方法に準じ、生後1日齢のWistar系ラットから摘出した左右脛骨、大腿骨を細切し、遊走してきた細胞をプラスチックのカバースリップ上に付着させ接着性の差により破骨細胞を単離した。破骨細胞が付着したカバースリップを24穴のディッシュに移し、37℃で15%FCSを含むIB培地にて0から2時間750pMのrhCSF-1(カイロン社より供与)の存在下で培養した。培養終了後,急冷し細胞膜を不動化し、pH4の酢酸緩衝液による洗浄でレセプターを露出させた。[I^<125>]rhCSF-1の特異的結合を見るために実験群では、15%FCSを含むIB培地、非特異的結合群では、代わりに2.0nMCSF-1を添加した同じ培地で0℃で1時間プレインキュベーションを行った。次に実験群には、最終濃度が、0.6nMの[I^<125>]rhCSF-1を非特異的結合群には、2.6nMの[I^<125>]rhCSF-1を添加し、0℃で20時間インキュベートした。通法により、オートラジオグラフィーを行い銀粒子の単位面積辺りの黒化度を画像解析した。破骨細胞のCSF-1レセプターは、CSF-1と結合後、速やかにDownmodulateされ膜表面より消失した。10分以内にほぼ90%が、1時間で完全に消失した。一旦Downmodulation後のCSF-1受容体の回復には,約2〜4時間必要であり、サイックロヘキシミドを加えた群では、この回復は完全に阻害された。この事より、受容体の回復には新規の蛋白合成が必要であった.以上によりCSF-1は破骨細胞の膜上にある受容体と結合し,受容体数を減少させることにより調節・制御するメカニズムがある可能性が示唆された.

根据Chambers等人的方法，将左侧和右胫骨和股骨从一日大的Wistar大鼠中提取成碎片，并将迁移的细胞连接到塑料盖玻片上，以分离粘附差异，以分离破骨细胞。在750 pm Rhcsf-1（由Chiron提供）的情况下（由Chiron提供），在37°C的IB培养基中，将整骨的盖玻片转移到24孔盘中，并在37°C中培养。培养完成后，将细胞膜迅速冷却以固定，并通过用pH 4醋酸盐缓冲液洗涤受体。为了观察RHCSF-1的特异性结合，在含有15％FC的同一培养基中，将实验组预孵育1小时，并将非特异性结合组预孵育，并在实验组的2.0 NMCSF-1补充的同一培养基中预孵育。接下来，将实验组添加到0°C下的[I^<125>] RHCSF-1的最终浓度中，将非特异性结合组添加到[I^<125>] RHCSF-1的最终浓度中，并在0°C中孵育20小时。使用一般方法，进行放射自显影以进行图像分析，以确定每个单位面积银颗粒的变黑程度。与CSF-1结合后，将破骨细胞的CSF-1受体迅速下调并从膜表面消失。在10分钟内，几乎90％在一个小时内完全消失了。 CSF-1受体的恢复一旦调节就需要大约2-4小时，并且添加了sycroheximide的组完全抑制了这种恢复。这表明新型蛋白质合成对于受体恢复是必需的。这表明CSF-1与位于破骨细胞膜上的受体结合，并且可能存在一种机制，通过减少受体数量来调节和调节受体数量。