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アスピリン非感受性プロスタグランジン合成酵素の遺伝子導入による基質プールの評価

通过阿司匹林不敏感的前列腺素合酶的基因导入来评估底物库

基本信息

批准号：
07772197
负责人：
堀隆光
金额：
$ 0.7万
依托单位：
Setsunan University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

プロスタグランジンは、生殖・炎症・血管系など様々な場面において、多様な生理作用を持っていることが知られている。プロスタグランジン生合成系における中心的な酵素はプロスタグランジンH合成酵素(PGHS)であり、PGHSはアスピリンや非ステロイド系抗炎症剤のターゲットとしても知られている。真核細胞においては、2種のPGHSのアイソザイム、PGHS-1とPGHS-2が存在する。両酵素の一次構造のホモロジーは60%で、VmaxとKmは両酵素ではほぼ同じ値を示す。両酵素間の最も大きな相違は発現制御の違いであるが、この二つの酵素の生理機能の相違はいまだ明確ではない。本研究は、両酵素が利用しうる基質プールに着目して両者の生体における寄与を明らかすることを目的とした。実験の第一過程として、アスピリン非感受性のPGHS-1とPGHS-2の遺伝子を安定的に含有し、しかもこれらのPGHSの発現を任意にオン/オフできる細胞を構築することを試みた。本研究で用いたベクターは、GossenとBujardによって樹立されたプラミスド系である。これは、テトラサイクリンオペロンに基づいた発現誘導システムで、2段階に発現が制御される。まず、ハイブリッド転写因子tet/vp16を含むpUHD15-1をハイグロマイシン耐性プラミスドpY3と共にNIH3T3細胞にトランスフェクションし、活性化因子tTAを構成的に産生する細胞を2株単離できた。次に、これらの細胞にアスピリン非感受性に修飾したPGHS遺伝子、PGHS-1-S532AとPGHS-2-S516Aのいずれかとネオマイシン耐性プラスミドpSV2Neoをコトランスフェクションし、培地からのテトラサイクリン除去により、PGHS-1-S532AとPGHS-2-S516Aの発現を誘導できる細胞クローンを探索した。しかし、第一のトランスフェクションで単離された2つの株のどちらに第二のトランスフェクションを行っても、目的タンパクの発現を誘導できる細胞株は得られなかった。原因は不明であるがプラスミドと細胞の組み合わせに問題がある可能性があり、次回は、親株となる細胞株NIH3T3を変更して同様の実験を行う予定である。これらの細胞が得られた後、さらに実験を進めたい。

The process of reproduction, inflammation, vascular system, various physiological functions, etc. The enzyme at the center of the biosynthesis system is called PGHS, which is an anti-inflammatory agent. In eukaryotes, two PGHS species, PGHS-1 and PGHS-2, exist. The primary structure of the enzyme is 60%, and the Vmax of the enzyme is 60%. The most important difference between enzymes is the difference between the physiological functions of enzymes. The purpose of this study is to investigate the use of enzymes in the body. In the first process of implementation, we are trying to build cells that can stably contain the non-receptive PGHS-1 and PGHS-2 genes and allow the development of these PGHS at will. This study was conducted with the help of Gossen and Bujard. This is the first step in the development of induction, and the second step in development. Two strains of NIH 3T3 cells were isolated from the cells containing pUHD15 -1, pUHD15 -1, and pUHD16, which produced pUHD15 -1, pUHD16, pUHD15 - 1, pUHD16, pUHD15 - 1, pUHD15 - 1, pUHD16, pUHD15 - 1, pUHD15 - 1, pUHD16, pUHD15 - 1, pUHD15 - 1, pUHD16, pUHD15 - 1, pUHD16, pUHD15 - 1, pUHD15 - 1, pUHD16, pUHD15 - 1, pUHD15 - 1, pUHD16, pUHD15 - 1, pUHD16, pUHD1 In addition, PGHS gene, PGHS-1-S532A and PGHS-2-S516A were found to be sensitive to cell death, PGHS-1-S532A and PGHS-2-S516A were found to be sensitive to cell death, PGHS-1-S532A and PGHS-2-S516A were found to be inducible. The cell lines were isolated from the first and second plants and induced to produce the target cells. The cause is unknown, the cell composition is uncertain, the possibility is uncertain, the parent cell line NIH3T3 is uncertain, and the cell composition is uncertain. The cells of the cell are in the middle of the cell.