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アスピリン非感受性プロスタグランジン合成酵素の遺伝子導入による基質プールの評価

通过阿司匹林不敏感的前列腺素合酶的基因导入来评估底物库

基本信息

批准号：
07772197
负责人：
堀隆光
金额：
$ 0.7万
依托单位：
Setsunan University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

プロスタグランジンは、生殖・炎症・血管系など様々な場面において、多様な生理作用を持っていることが知られている。プロスタグランジン生合成系における中心的な酵素はプロスタグランジンH合成酵素(PGHS)であり、PGHSはアスピリンや非ステロイド系抗炎症剤のターゲットとしても知られている。真核細胞においては、2種のPGHSのアイソザイム、PGHS-1とPGHS-2が存在する。両酵素の一次構造のホモロジーは60%で、VmaxとKmは両酵素ではほぼ同じ値を示す。両酵素間の最も大きな相違は発現制御の違いであるが、この二つの酵素の生理機能の相違はいまだ明確ではない。本研究は、両酵素が利用しうる基質プールに着目して両者の生体における寄与を明らかすることを目的とした。実験の第一過程として、アスピリン非感受性のPGHS-1とPGHS-2の遺伝子を安定的に含有し、しかもこれらのPGHSの発現を任意にオン/オフできる細胞を構築することを試みた。本研究で用いたベクターは、GossenとBujardによって樹立されたプラミスド系である。これは、テトラサイクリンオペロンに基づいた発現誘導システムで、2段階に発現が制御される。まず、ハイブリッド転写因子tet/vp16を含むpUHD15-1をハイグロマイシン耐性プラミスドpY3と共にNIH3T3細胞にトランスフェクションし、活性化因子tTAを構成的に産生する細胞を2株単離できた。次に、これらの細胞にアスピリン非感受性に修飾したPGHS遺伝子、PGHS-1-S532AとPGHS-2-S516Aのいずれかとネオマイシン耐性プラスミドpSV2Neoをコトランスフェクションし、培地からのテトラサイクリン除去により、PGHS-1-S532AとPGHS-2-S516Aの発現を誘導できる細胞クローンを探索した。しかし、第一のトランスフェクションで単離された2つの株のどちらに第二のトランスフェクションを行っても、目的タンパクの発現を誘導できる細胞株は得られなかった。原因は不明であるがプラスミドと細胞の組み合わせに問題がある可能性があり、次回は、親株となる細胞株NIH3T3を変更して同様の実験を行う予定である。これらの細胞が得られた後、さらに実験を進めたい。

プロスタグランジンは, reproduction, inflammation, vascular system など様々な scene において, many 様なphysiological effects をhold っていることが知られている. The なzyme はプロスタグランジンH synthesis enzyme (PGHS) of the プロスタグランジンsynthetic system におけるcenter ) であり, PGHS はアスピリンや non-ステロイド is an anti-inflammatory のターゲットとしても知られている. There are two types of eukaryotic cells: PGHS, PGHS-1 and PGHS-2.両Enzyme's primary structure のホモロジーは60%で, VmaxとKmは両Enzyme ではほぼ Same as じをshow す.両The biggest difference between enzymes is that they are contrary to each other, and the physiological functions of enzymes are contradictory and clear. In this study, the use of enzyme substrates and enzymes were directed to the biotechnological research institute and to the purpose of this study. The first process of 実験として、アスピリンnon-sensitiveのPGHS-1とPGHS-2の伝子を stabilizedにContains し, しかもこれらのPGHSの発成をarbitrary にオン/オフできるcell をconstruct することをtrial みた. In this study, we established the されたプラミスド system with the use of Gossen and Bujard.これは, テトラサイクリンオペロンに记づいた発 appear to induce システムで, 2-stage に発appears to control される.まず、ハイブリッド転WRITING FACTOR tet/vp16を有むpUHD15-1をハイグロマイシンresistantプラミスドpY3 NIH3T3 cells are produced by 2 separate strains of TIKON, which are composed of NIH3T3 cells and activating factor tTA. Secondary, これらのcell にアスピリン non-receptive にmodified PGHS remaining child, PGHS-1-S 532AとPGHS-2-S516Aのいずれかとネオマイシンresistant プラスミドpSV2N eoをコトランスフェクションし, 平地からのテトラサイクリン出により, PGHS- 1-S532A and PGHS-2-S516A are used to induce cells and explore them.しかし, the first one is the first one The フェクションを行っても, the purpose of the タンパクの発成をinduced できる cell line and the られなかった. The reason is unknown, the problem is the possibility, the cell combination is not clear, Next time, the parent strain, the NIH3T3 cell strain, has been updated and the same is the same as the original one.これらの片が got られた后, さらに実験を入めたい.