動物細胞における膜リン脂質変換酵素ホスホリパーゼDの機能解析

ホスホリパーゼD(PLD)は種々の細胞外刺激によって活性化されることが知られている。そして本酵素によるリン脂質の代謝産物であるホスファチジン酸、ジアシルグリセロールは細胞内メッセンジャーとして機能することからPLDは細胞外刺激を細胞内刺激へと変換する情報変換因子として機能していることが予想されている。しかしながら、この酵素が細胞内で具体的にどのような機能を司っているのかという点に関しては不明な点が多く残されている。本研究ではコロニーレプリカ法によりCHO細胞からPLD欠損変異株を作成し、機能を遺伝生化学的に解析することを目的としている。まず、変異株スクリーニングのassay系の確立をめざした。はじめにCHO細胞膜画分を用いたPLD活性測定系を樹立した。PLDは底分子量G蛋白質であるARFによってin vitroで活性化されることが知られていた。そこでCHO細胞においてもヒト・リコンビナントARFによる活性化が認められることを確認し、CHO細胞PLDのin vitro assay系を確立した。つぎにPLD活性による^<14>C-エタノール、^<14>C-ブタノールのリピド画分への取り込みによるコロニーレプリカアッセイが可能か解析した。しかしながら活性が弱いために、この方法によるコロニーレプリカアッセイは不可能と判断した。そこでPLD活性によって合成されるホスファチジルエタノールおよびホスファチジルブタノールに対する抗体を作成し、コロニーレプリカアッセイに用いることを考え、現在抗体の作成を試みている。方法は、合成したホスファチジルエタノールおよびホスファチジルブタノールをTLCプレートシリカゲル担体に付着した状態でウサギに免疫させるやり方で行っている。現段階では変異株スクリーニングのassay系の確立には至っていない。抗体の作成には時間がかかるが、地道にboostを継続しスクリーニングに用いることのできる抗体を得たいと考えている。

ホスホリパーゼD(PLD)は種々の細胞外刺激によって活性化されることが知られている。そして本酵素によるリン脂質の代謝産物であるホスファチジン酸、ジアシルグリセロールは細胞内メッセンジャーとして機能することからPLDは細胞外刺激を細胞内刺激へと変換する情報変換因子として機能していることが予想されている。しかしながら、この酵素が細胞内で具体的にどのような機能を司っているのかという点に関しては不明な点が多く残されている。本研究ではコロニーレプリカ法によりCHO細胞からPLD欠損変異株を作成し、機能を遺伝生化学的に解析することを目的としている。まず、変異株スクリーニングのassay系の確立をめざした。はじめにCHO細胞膜画分を用いたPLD活性測定系を樹立した。PLDは底分子量G蛋白質であるARFによってin vitroで活性化されることが知られていた。そこでCHO細胞においてもヒト・リコンビナントARFによる活性化が認められることを確認し、CHO細胞PLDのin vitro assay系を確立した。つぎにPLD活性による^<14>C-エタノール、^<14>C-ブタノールのリピド画分への取り込みによるコロニーレプリカアッセイが可能か解析した。しかしながら活性が弱いために、この方法によるコロニーレプリカアッセイは不可能と判断した。そこでPLD活性によって合成されるホスファチジルエタノールおよびホスファチジルブタノールに対する抗体を作成し、コロニーレプリカアッセイに用いることを考え、現在抗体の作成を試みている。方法は、合成したホスファチジルエタノールおよびホスファチジルブタノールをTLCプレートシリカゲル担体に付着した状態でウサギに免疫させるやり方で行っている。現段階では変異株スクリーニングのassay系の確立には至っていない。抗体の作成には時間がかかるが、地道にboostを継続しスクリーニングに用いることのできる抗体を得たいと考えている。