動物細胞における膜リン脂質変換酵素ホスホリパーゼDの機能解析

动物细胞膜磷脂转换酶磷脂酶D的功能分析

• 批准号: 07772209
• 负责人: 川崎 清史
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: 国立予防衛生研究所
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07772209/
• 关键词: ホスホリパーゼD; ホスファチジン酸; CHO細胞

ホスホリパーゼD(PLD)は種々の細胞外刺激によって活性化されることが知られている。そして本酵素によるリン脂質の代謝産物であるホスファチジン酸、ジアシルグリセロールは細胞内メッセンジャーとして機能することからPLDは細胞外刺激を細胞内刺激へと変換する情報変換因子として機能していることが予想されている。しかしながら、この酵素が細胞内で具体的にどのような機能を司っているのかという点に関しては不明な点が多く残されている。本研究ではコロニーレプリカ法によりCHO細胞からPLD欠損変異株を作成し、機能を遺伝生化学的に解析することを目的としている。まず、変異株スクリーニングのassay系の確立をめざした。はじめにCHO細胞膜画分を用いたPLD活性測定系を樹立した。PLDは底分子量G蛋白質であるARFによってin vitroで活性化されることが知られていた。そこでCHO細胞においてもヒト・リコンビナントARFによる活性化が認められることを確認し、CHO細胞PLDのin vitro assay系を確立した。つぎにPLD活性による^<14>C-エタノール、^<14>C-ブタノールのリピド画分への取り込みによるコロニーレプリカアッセイが可能か解析した。しかしながら活性が弱いために、この方法によるコロニーレプリカアッセイは不可能と判断した。そこでPLD活性によって合成されるホスファチジルエタノールおよびホスファチジルブタノールに対する抗体を作成し、コロニーレプリカアッセイに用いることを考え、現在抗体の作成を試みている。方法は、合成したホスファチジルエタノールおよびホスファチジルブタノールをTLCプレートシリカゲル担体に付着した状態でウサギに免疫させるやり方で行っている。現段階では変異株スクリーニングのassay系の確立には至っていない。抗体の作成には時間がかかるが、地道にboostを継続しスクリーニングに用いることのできる抗体を得たいと考えている。

The gene is activated by extracellular stimulation. The enzyme produces lipid metabolites, such as acid, protein, and protein. The enzyme produces intracellular protein, such as protein, protein, and protein. The enzyme is specific to the cell, functional to the cell, and not specific to the cell. This study aims to analyze the biological characteristics of CHO cells, PLD mutants and their functions. The assay system for the detection and identification of different species is established. A system for measuring PLD activity in CHO cell membranes was established. PLD has a lower molecular weight than G protein. CHO cell PLD in vitro assay was established. The PLD <14>activity can be analyzed by the following methods<14>: It is impossible to judge whether the activity is weak or not. The preparation of antibodies against PLD in the context of PLD activity was studied. The method is to combine all the information in the form of a TLC file with the information in the form of a file. At this stage, the assay system of different strains is established. The antibody is produced in a timely manner, and the boost is applied to the antibody.