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迅速冷却によるグルタチオン合成酵素反応中の準安定構造のX線結晶解析

快速冷却谷胱甘肽合成酶反应过程中亚稳态结构的 X 射线晶体学

基本信息

批准号：
06760085
负责人：
加藤博章
金额：
$ 0.64万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06760085/
关键词：
迅速冷却グルタチオン合成酵素酵素反応 X線結晶解析

项目摘要

1.グルタチオン合成酵素にγグルタミルシステイン依存性ATP加水分解活性があることを見いだした。この活性は、通常本来のグルタチオン合成活性の2%以下に押さえられているものの、活性中心を覆っていると考えられるフレキシブルループを削除することによってその割合が上昇した。すなわち、フレキシブルループは、アシルリン酸中間体とグリシンとの反応を制御していると考えられる。2.このATP加水分解活性に注目し、反応途中の酵素基質複合体をX線結晶解析で捕捉することを目的として以下の系を構築した。すなわち、caged-ATPと呼ばれる光照射によって外れる保護基を導入されたATPとγグルタミルシステインをグルタチオン合成酵素と共存させて結晶化し、得られた複合体酵素の結晶にフラッシュを照射することで反応を開始直後、結晶を迅速に冷却することによって反応を停止させ、その状態をX線結晶構造解析するものである。(1)結晶中においてグルタチオン合成酵素によって触媒されるγグルタミルシステイン依存性のATP加水分解反応を、HPLCを用いて定量した。次いで、グルタチオン合成酵素とcaged-ATP及びγグルタミルシステインとの複合体結晶を作成し、フラッシュフォトリシスによってcaged-ATPからATPを放出させた後、20℃にて反応させたところ、結晶状態のグルタチオン合成酵素によって、70時間後に60%のATPがADPに、4日後には、90%のATPがADPに変換されていることが判明した。(2)反応開始直後と反応終了時の結晶を0℃に冷やすことでほぼ反応を停止させ、その状態のX線回折強度を測定した。その結果、酵素によって加水分解される直前のATPの構造を捉えることに成功した。また、ATPの加水分解にともない166番目と167番目のグリシン残基が大きく構造変化することが観測された。

1. The activity of ATP hydrolysis is dependent on the activity of γ-ray synthase. This activity is usually less than 2% of the original group activity, and the activity center is reduced. A study of the relationship between the two substances in the medium and the reaction between them. 2. The enzyme matrix complex in the ATP hydrolysis process was analyzed by X-ray crystallography. The protective group introduced by the light irradiation of ATP, caged-ATP and ATP was converted into ATP and γ-ray. The enzyme was crystallized and the complex enzyme was crystallized. After the irradiation, the reaction was started and the crystallization was cooled rapidly. The reaction was stopped and the state of the enzyme was analyzed by X-ray crystal structure. (1)Crystallization of the enzyme in the synthesis of the enzyme in the reaction of ATP hydrolysis, HPLC analysis The crystal of the complex of caged-ATP and γ-ATP synthase was prepared at 20℃, and the crystal state of the complex of ATP synthase was determined after 70 hours. After 4 days, 60% ATP and 90% ATP were converted. (2)The X-ray reflection intensity of the crystal at the beginning and end of the reaction was measured at 0℃ and at the end of the reaction The structure of ATP was successfully synthesized by enzyme hydrolysis. A large number of structural changes were observed in the hydrolysis of ATP at 166 and 167 sites.

项目成果

期刊论文数量（1）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

加藤博章: "Flexible Loop That Is Novel Catalytic Machinery in a Ligase. Atomic Structure and Function of the Loopless Glutathione Synthetase" Biochemistry. 33. 4995-4999 (1994)

Hiroaki Kato：“柔性环是连接酶中的新型催化机制。无环谷胱甘肽合成酶的原子结构和功能”生物化学 33. 4995-4999 (1994)。

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通讯作者：
F.Yokokawa