高度好熱菌RecA蛋白質を用いたDNA組換え反応の解析

使用高度嗜热 RecA 蛋白分析 DNA 重组反应

• 批准号: 07780512
• 负责人: 加藤 龍一
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07780512/
• 关键词: RecA蛋白質; 高度好熱菌; 遺伝的組換え; DNA修復

大腸菌内で大量に発現させた高度好熱菌RecA蛋白質を精製し、以下の実験に用いた。まず、精製蛋白質が熱、pHに対して安定であるかどうかについて、円偏光二色性とATP加水分解活性を指標にして測定した。その結果、高温については75℃まで、pHについては5から少なくとも12まで安定であることが分かった。次に、高度好熱菌RecA蛋白質と単鎖DNAとの複合体形成について、電子顕微鏡を用いて調べたところ、37℃・65℃のどちらにおいても複合体が形成されていた。一方、ATP加水分解活性を促進する単鎖DNAは、65℃では、poly(dC)>poly(dT)>poly(dA)の順で、37℃では、poly(dC)とpoly(dT)のみであった。また、単鎖DNAの構造を真空紫外域のCDで調べたところ、poly(dA)は温度による構造転移があったが、poly(dC)とpoly(dT)は無いことが分かった。これらの結果は、RecA蛋白質が単鎖DNAの構造を認識して複合体を形成する、という新しい発見を強く示唆している。(加藤他(1995)第18回 日本分子生物学会年会講演要旨集、p.379)さらに、RecA蛋白質とDNAとの相互作用をその立体構造に基づいて解析するためにX線構造解析のために蛋白質の結晶化を試みた。高度好熱菌RecA蛋白質を材料としてRecA蛋白質単独での結晶化に成功し、20オングストローム分解能に相当するX線回折像を得た。また、単鎖DNAを含む条件下での結晶化にも成功した。(加藤他(1995)生化学Vol.67,No.7,p.770)

A large number of bacteria are found in Escherichia coli, which is highly resistant to heat. RecA protein is purified and used in the following ways. Heat, pH, stability, polarization dichroism, ATP hydrolysis activity Fruit, high temperature Second, highly thermophilic bacteria RecA protein and DNA complex formation, electron microscopy, 37 ° C·65 ° C and temperature control complex formation One side, ATP hydrolysis activity is promoted, single lock DNA, 65℃, poly(dC)>poly(dT)>poly(dA), 37℃, poly(dC)> poly(dT). The structure of DNA in the vacuum ultraviolet domain is modulated by the temperature of poly(dA). The structure of DNA in the vacuum ultraviolet domain is shifted by poly (dC). As a result, RecA protein is found in the structure of DNA, and the formation of new complexes is strongly demonstrated. Kato, T.(1995) Proceedings of the 18th Annual Meeting of the Japanese Society for Molecular Biology, p. 379. The high temperature bacteria RecA protein material was successfully crystallized, and the X-ray image was obtained after 20 minutes of decomposition. Crystallization was successfully carried out in the presence of DNA. (Kato Ta (1995) Biochemistry Vol. 67, No. 7, p. 770)