高度好熱菌蛋白質を用いたDNA修復・突然変異誘発機構の解析

使用超嗜热蛋白分析 DNA 修复和诱变机制

• 批准号: 09269215
• 负责人: 加藤 龍一
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09269215/
• 关键词: DNA修復; ミスマッチ修復; ヌクレオチド除去修復; 塩基除去修復; 組換え修復; 光回復; 高度好熱菌; ドメイン構造

ミスマッチ修復を担うMutS,L,UvrD蛋白質のうち、MutSについては変性実験と限定分解実験から4つの構造ドメインからなると推定された。そして、これらのドメインのうち中央部に位置するドメインが2本鎖DNAと相互作用する領域であることを明らかにした。また、これら構造ドメインの情報を元にして断片化遺伝子を作成し、それらの大量発現と精製を行った。MutSとヌクレオチドとの相互作用の解析を行い、ATPに対するKmは0.1μMと非常に小さいこと、2価のカチオンが存在しなくてもヌクレオチドと相互作用できること、を明らかにした。親和標識試薬を用いてATP結合部位を決定したところ、Walker A-typeとは異なる部位のLys171がMgイオンの有無によるATPの結合様式に関わっていることが示された。MutL,UvrDについては、遺伝子のクローニングと塩基配列の決定を行い、蛋白質の大量発現系の構築と精製法の確立を行った。また、塩基除去修復に関わるMutMの遺伝子の単離と蛋白質の解析を行った。MutM蛋白質は、安定で高温まで活性があり、変性実験から2つの構造ドメインからなることが示唆された。ヌクレオチド除去修復遺伝子のうち、UvrBは4つの構造ドメインからなり、それらドメインとATP加水分解活性に必要な部位・単鎖DNA結合に必要な部位・UvrAとの結合に必要な部位、等の関係を明らかにした。UvrAは高塩濃度では溶液中で粒状性の揃った2量体を形成することを動的溶液散乱法を用いて明らかにし、この条件下で結晶を得ることに成功した。光回復酵素の性質を調べたところ、安定性が高く高温まで活性がある他、他の生物種との比較から、高度好熱菌の光回復酵素は第3のグループである可能性が示唆された。RecAは変性剤が無い状態では多量体を形成しているが、低濃度の変性剤が存在すると単量体になることがゲル濾過によって明らかになった。円2色性スペクトル測定より、この単量体形成にはN末端部のαヘリックスの部分的変性が関与していることが明らかになった。

MutS,L,UvrD protein, MutS protein 2. DNA interaction domain The information of the structure is divided into three parts: the information of the structure is divided into four parts: the information of the structure The analysis of MutS interaction is in progress, ATP is in progress, Km is 0.1μM, Km is very small, Km is 2 μ M, Km is in existence, Km is in existence. Affinity labeling assay is used to determine ATP binding site, Walker A-type, Lys171, Mg, and ATP binding pattern. MutL,UvrD detection, determination of gene base alignment, construction of protein mass production system and establishment of purification method MutM gene expression and protein analysis are important for gene repair. MutM protein is stable and active at high temperatures. UvrB and UvrA are the essential sites for ATP hydrolysis activity. UvrB and UvrA are the essential sites for DNA binding. UvrA is highly concentrated in solution and forms granular particles. The solution dispersion method is successful in obtaining crystals under these conditions. The properties of photorevertase are regulated, the stability is high, the activity is high, the biological species is high, the photorevertase of thermophilic bacteria is high, the possibility of photorevertase is high. RecA is a non-reactive substance that forms multiple substances, and a reactive substance that exists at low concentrations. 2. The color of the sample is determined by the color of the sample.

项目成果

N. Nakagawa et al.: "UvrB protein has a similarity in domain structure with a helicase" J. Biol. Chem.272. 22703-22713 (1997)

N. Nakakawa 等人：“UvrB 蛋白在结构域结构上与解旋酶相似”，J. Biol。

N. Nakagawa et al.: "Analysis of domain organization of thermus thermophilus UvrB protein using limited proteolysis and denaturation" Protein Science. 6S2. 106-106 (1997)

N. Nakakawa 等人：“利用有限的蛋白水解和变性分析嗜热菌 UvrB 蛋白的结构域”《蛋白质科学》。

Y.Hiramatsu et al.: "Cloning and characterization of the uvrD gene from an extremely thermophilic bacterium,Thermus thermophilus HB8" Gene. 199. 77-82 (1997)

Y.Hiramatsu 等人：“来自极端嗜热细菌，嗜热栖​​热菌 HB8 的 uvrD 基因的克隆和表征”基因。

T. Mikawa et al.: "Difference in structural stability between Escherichia coli and Thermus thermophilus RecA proteins in the presence of denaturant" Protein Science. 6S2. 82-82 (1997)

T. Mikawa 等人：“变性剂存在下大肠杆菌和嗜热栖热菌 RecA 蛋白结构稳定性的差异”《蛋白质科学》。

R. Kato et al.: "Characterization of thermostable DNA photolyase from an extremely thermophilic bacterium, Thermus thermophilus HB27" J. Bacteriol.179. 6499-6503 (1997)

R. Kato 等人：“来自极端嗜热细菌，嗜热栖​​热菌 HB27 的热稳定性 DNA 光裂合酶的表征”J. Bacteriol.179。