染色体分配に関与するMukBタンパクのモーター蛋白としての機能の研究

MukB蛋白作为运动蛋白参与染色体分离的功能研究

基本信息

批准号：
07780576
负责人：
仁木宏典
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Kumamoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07780576/
关键词：
MukBタンパク ATP加水分解反応 Mg2+

项目摘要

本年度の研究目的であるMukB蛋白のATP加水分解活性を明らかにすることができた。放射性標識化ATPを用いこの加水分解産物であるADPを薄層クロマトグラフィーによって分離、検出しさらに検出したADPを定量することによって精製MukBタンパクのATP加水分解反応を明らかにすることができた。まず、このATP加水分解反応はMg2+依存性であることを明らかになった。すなわち、MukBタンパクのATP加水分解活性は1mMのMg2+存在下でみられるが、Mg2+のキレート剤である1mMEDTAをこの反応液へ添加することによりMukBタンパクのATP加水分解反応は阻害された。さらに、この中にMg2+を加えてキレート剤の影響を打ち消すと再びATP加水分解反応が観察され、このEDTAの阻害効果は見られられなくなった。MukBタンパクの精製はこのタンパクを過剰生産する菌株から行い、その検出の指標には電気泳動によるタンパクの分子量を用いてきた。MukBタンパクの精製過程の一つであるゲルろ過クロマトグラフィーで分離精製した分画でATP加水分解反応見てみたところ、MukBタンパクの溶出ピークと一致してATP加水分解反応のピークが観察された。このことからもMukBタンパクがATP加水分解活性を持つことが示唆された。酵素学的に測定したところMukBタンパクの最大反応速度(Vmax)とミカエリ定数(Km)はそれぞれ、8.4nmol/min/mg、0.13mMでありATP加水分解酵素としての活性は弱いものであった。この活性を増強させる因子の存在を探索するため野生株から細胞質画分と細胞膜画分を抽出しこれをさらにゲルろ過クロマトグラフィーで細かく再度分画した。これらの各分画を精製MukBタンパクに加え、MukBタンパクのATP加水分解活性を増強させる分画があるか調べた。しかしながら、細胞質画分と細胞膜画分ともにMukBタンパクのATP加水分解活性を増強させる分画を検出することができなかた。MukBタンパクはオペロンを形成しているMukE,Fタンパクと相互作用している可能性があらたに示唆されている。MukBタンパクのATP加水分解活性に対するこれらタンパクの影響を引き続き検討中である。

MUKB蛋白的ATP水解活性是今年研究的目的，能够澄清。使用放射性标记的ATP，通过薄层色谱法分离了该水解产物ADP，并进一步量化了检测到的ADP，从而阐明了纯化的MUKB蛋白的ATP水解反应。首先，揭示了该ATP水解反应是Mg2+依赖性的。也就是说，尽管在存在1 mM MG2+的情况下观察到MUKB蛋白的ATP水解活性，但通过添加1 mM EDTA（MG2+的螯合剂）抑制MUKB蛋白的ATP水解反应，以此为此反应溶液。此外，当将MG2+添加到以取消螯合剂的效果中时，再次观察到ATP水解反应，并且不再观察到该EDTA的抑制作用。 MUKB蛋白是从过量生产该蛋白质的菌株中纯化的，蛋白的分子量是电泳作为检测指标的。当在通过凝胶过滤色谱分离并纯化的馏分中观察到ATP水解反应时，MUKB蛋白的纯化过程之一，与MUKB蛋白的洗脱峰一致观察到ATP水解反应的峰。这也表明MUKB蛋白具有ATP水解活性。通过酶角测得的MUKB蛋白的最大反应速率（VMAX）和Michaeli常数（KM）分别为8.4 nmol/min/mg和0.13 mm，作为ATP水解酶的活性较弱。为了搜索增强该活性的因素的存在，从野生应变中提取细胞质和细胞膜分数，并通过凝胶过滤色谱法再次分级。将这些馏分中的每一个都添加到纯化的MUKB蛋白中，并检查以查看是否有任何馏分增强了MUKB蛋白的ATP水解活性。但是，不可能检测到增强MUKB蛋白ATP水解活性的细胞质和细胞膜级分。现在建议MUKB蛋白可能与形成操纵子的Muke和F蛋白相互作用。这些蛋白质对MUKB蛋白的ATP水解活性的影响正在继续研究。