プラスミドR64の接合伝達開始の分子機構に関する研究

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本年度は、バクテリアのプラスミドであるR64のoriTの領域に於ける、DNA伝達の開始と終結のメカニズムについて解析を行った。(1)oriT配列中の機能領域の同定:接合伝達起点(oriT)をクローン化したプラスミドを用いて、oriT配列の欠失、置換変異を作成し、大腸菌内でのリラクセイションコンプレックスの形成を調べた結果、NikABタンパクによるニックの導入に必要な領域は、ニック部位周辺とリピートA配列(17bp)を含む44bpのコア配列内に存在することが明らかとなった。また、2個のoriT配列を同一のベクタープラスミド上に並列にクローン化し、接合伝達によって可動化実験を行い、DNA伝達の開始と終結に必要な領域を同定した。様々な長さのoriT配列を用いて上記の実験を行った結果、DNA伝達開始に必要な領域は、44bpのコア配列内に存在しており、リラクセイションコンプレックスの形成に必要な配列と一致していた。これに対して、DNA伝達終結に必要な配列はコア配列以外の部分も含む92bpの領域内に存在しており、これらの領域に含まれるリピートB及び8bpの逆向き反復配列の関与が示唆された。(2)nikA遺伝子への突然変異の導入とその解析:マンガンPCRを用いて、nikA遺伝子に多数の変異を導入した。得られた変異のうち、ナンセンス変異体の解析から、NikAタンパク質のN末端側52アミノ酸の領域にDNA結合ドメインが存在していることが明らかとなった。