薬剤耐性プラスミドの複製・維持・接合伝達を制御する細胞マシーナリーとの相互作用

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腸球菌（Enterococcus spp.）流行株の間で拡散している薬剤耐性プラスミドの動態を解析するための技術的基盤の整備を行なった。特にこれまで効率的な遺伝子組み換え技術がなかったEnterococcus faeciumにおいて効率的にmarker-lessのallele exchangeを行う組換え系の構築に成功した。この組換えでは従来でも用いられてきた温度感受性プラスミドが基盤となるが、本研究においてネガティブセレクション遺伝子を導入することにより、second crossing overが生じたクローンを選択することができ、大幅に実験期間ならびにスクリーニングのサイズを縮小することができた。また、外来的遺伝子発現カセットの最適化を行なった。腸球菌のRNA-seqデータより様々な発現強度を示すプロモーターを選択し、lacI遺伝子上流にクローン化した。一方、lacO配列を含むIPTG誘導性プロモーター下流に、蛍光レポーター遺伝子あるいは発光レポーター遺伝子をクローン化し、各カセットの発現制御を解析した。これまでに、非誘導時のベースラインが極めて低いものや、発現誘導時に高い発現レベルを達成できるものなど、使徒に応じて選択できる誘導系のコレクションが取得できた。一方、顕微鏡観察を用いた観察の結果、抗生物質などの外因的な選択圧によって選択ゲノムから独立して複製・維持されるシャトルベクターを用いた場合、上述の遺伝子カセットの発現が極めて不均一で、表現型の解析には不適であることが明らかになった。一方、染色体や大型プラスミドを含むゲノムへの発現導入では、外来的な選択圧を要することなく均一で安定な遺伝子カセットが導入されることがわかった。