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薬剤耐性プラスミドの複製・維持・接合伝達を制御する細胞マシーナリーとの相互作用

与控制耐药质粒复制、维持和接合转移的细胞机器相互作用

基本信息

批准号：
22K07052
负责人：
久留島潤
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Gunma University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2026-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

腸球菌（Enterococcus spp.）流行株の間で拡散している薬剤耐性プラスミドの動態を解析するための技術的基盤の整備を行なった。特にこれまで効率的な遺伝子組み換え技術がなかったEnterococcus faeciumにおいて効率的にmarker-lessのallele exchangeを行う組換え系の構築に成功した。この組換えでは従来でも用いられてきた温度感受性プラスミドが基盤となるが、本研究においてネガティブセレクション遺伝子を導入することにより、second crossing overが生じたクローンを選択することができ、大幅に実験期間ならびにスクリーニングのサイズを縮小することができた。また、外来的遺伝子発現カセットの最適化を行なった。腸球菌のRNA-seqデータより様々な発現強度を示すプロモーターを選択し、lacI遺伝子上流にクローン化した。一方、lacO配列を含むIPTG誘導性プロモーター下流に、蛍光レポーター遺伝子あるいは発光レポーター遺伝子をクローン化し、各カセットの発現制御を解析した。これまでに、非誘導時のベースラインが極めて低いものや、発現誘導時に高い発現レベルを達成できるものなど、使徒に応じて選択できる誘導系のコレクションが取得できた。一方、顕微鏡観察を用いた観察の結果、抗生物質などの外因的な選択圧によって選択ゲノムから独立して複製・維持されるシャトルベクターを用いた場合、上述の遺伝子カセットの発現が極めて不均一で、表現型の解析には不適であることが明らかになった。一方、染色体や大型プラスミドを含むゲノムへの発現導入では、外来的な選択圧を要することなく均一で安定な遺伝子カセットが導入されることがわかった。

Enterococcus spp. The development of the technology base for the analysis of plant dynamics In particular, the marker-less allele exchange system was successfully constructed by using the Enterococcus faecium technology. The composition of this study is based on the introduction of temperature sensitivity factors into the substrate. The second crossing over the selection of temperature sensitivity factors is based on the reduction of temperature sensitivity factors. In addition, the optimization of the development of exotic genes is carried out. Enterococcus RNA-seq gene expression intensity is indicated by the expression of RNA, lacI gene expression. A side, lacO alignment, including IPTG induction, down-stream, down-stream, down- In this case, the induction system can be obtained by selecting the induction system from the induction system. The results of microscopical observation, selection of antibiotics and exogenous factors, selection of antibiotics, selection of independent replication and maintenance, and application of these factors are extremely heterogeneous, and phenotypic analysis is not appropriate. A large number of chromosomes were introduced into the genome, and foreign chromosomes were introduced into the genome.