土壌硝化細菌のアンモニアモノオキシゲナーゼ遺伝子のPCRによる検出

土壤硝化细菌氨单加氧酶基因的PCR检测

• 批准号: 07760065
• 负责人: 横山 和平
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Kagawa University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07760065/
• 关键词: 硝酸化成菌; アンモニアモノオキシゲナーゼ; amo; PCR; 特異的ブローブ; サザンハイブリダイゼーション

本研究計画の申請時以降現在までに数種アンモニア酸化菌のアンモニアモノオキシゲナーゼ(AMO)遺伝子(amo)の塩基配列がデータベースに登録されたので、適宜利用した。またこのため、申請書の計画の一部を割愛し、より先に進めた。N.europaeaATCC25978及びN.multiformis ATCC25196から得たDNAを鋳型として、N.europaeaのアンモニアモノオキシゲナーゼのアミノ酸配列を基に当研究室で設計したオリゴヌクレオチドをプライマーとしてPCRを行った。N.europaeaからの増幅産物についてその大部分の塩基配列を決定したところ、既報のN.europaeaのamoの塩基配列と98%の相同性が得られた。また、N.multiformisからの増幅産物は、サザンハイプリの結果この細菌のamoに特異的なプローブとハイブリダイズした。しかしながら、ここで用いたPCRプライマーでは、N.multiformisではN.europaeaに比べアニーリング温度を10℃下げる必要があり、極めて多量の鋳型DNAを必要とした。このため、更に高感度で特異性の高いプライマーを設計し、Nested PCRを試みた。プライマーはamoに近縁のpmoを含めて増幅する組み合わせと、その内側のβ-Proteobacteriaのアンモニア酸化菌のamoに特異的な領域を標的としてより厳しい条件で増幅する組み合わせの2組を用いた。その結果、N.europaea及びN.multiformisの両者からフェムトグラムオーダーの鋳型DNA量から増幅産物が得られた。データベースに登録されたamoの塩基配列にみられる両者の増幅産物の差、約20bpはアガロースゲル電気泳動では区別できなかったが、特異的プローブを用いたサザンハイブリによりPCR産物の起源を識別できた。ここで設計したPCRプライマーを用いて、間接抽出法で得た土壌DNAを鋳型としてNested PCRを行い、amo遺伝子の検出を試みた。供試土壌はイチゴ栽培施設土壌で、アンモニア酸化菌密度は生土1g当たり4×10^4だった。土壌DNAを鋳型としても、純粋培養のN.europaeaDNAからと同じ位置に泳動されるバンドを得た。また、サザンハイブリによりN.europaeaのamoの特異的プローブとハイブリすることを確認した。

The purpose of this study is to apply for several kinds of acid bacteria, acid bacteria, acid bacteria Let's talk about it, let's talk about it. The N.europaeaATCC25978 and the N.multiformis ATCC25196 system can be used in the field of DNA, N.europaea, and N.europaea systems. In the laboratory, there are significant differences in the performance of the laboratory. Most of the N.europaea devices are based on the determination of the base column, and the similarity of the base column is 98%, which is the same as that of the N.europaea column. This is the first time that N.multiformis has been used. The results show that the bacteria of the amo special group are very sensitive. The temperature is 10 ℃, the temperature is 10 ℃. High sensitivity, high sensitivity The current amo pmo contains a combination of components, β-Proteobacteria, acid bacteria, acidified bacteria, acidified The results, N.europaea and N.multiformis test results showed that the amount of DNA was significantly higher than that of the control group. For example, if you want to register your amo, you will find that there is a difference in the size of the product, and that you will need to know the difference between the 20bp and the source of the PCR. The local PCR test and amo sub-test were obtained by using the local DNA filter and the connection pull-out method. The density of acidified bacteria is 1g of raw soil when the density of acidified bacteria is 1g, and the density of acidified bacteria is 1g. Local DNA training, N.europaeaDNA training, swimming in the same position, swimming, swimming and swimming. Please tell me that you need to confirm that you are using the N.europaea amo device.