土壌硝化細菌のアンモニアモノオキシゲナーゼ遺伝子のPCRによる検出

土壤硝化细菌氨单加氧酶基因的PCR检测

• 批准号: 07760065
• 负责人: 横山 和平
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Kagawa University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07760065/
• 关键词: 硝酸化成菌; アンモニアモノオキシゲナーゼ; amo; PCR; 特異的ブローブ; サザンハイブリダイゼーション

本研究計画の申請時以降現在までに数種アンモニア酸化菌のアンモニアモノオキシゲナーゼ(AMO)遺伝子(amo)の塩基配列がデータベースに登録されたので、適宜利用した。またこのため、申請書の計画の一部を割愛し、より先に進めた。N.europaeaATCC25978及びN.multiformis ATCC25196から得たDNAを鋳型として、N.europaeaのアンモニアモノオキシゲナーゼのアミノ酸配列を基に当研究室で設計したオリゴヌクレオチドをプライマーとしてPCRを行った。N.europaeaからの増幅産物についてその大部分の塩基配列を決定したところ、既報のN.europaeaのamoの塩基配列と98%の相同性が得られた。また、N.multiformisからの増幅産物は、サザンハイプリの結果この細菌のamoに特異的なプローブとハイブリダイズした。しかしながら、ここで用いたPCRプライマーでは、N.multiformisではN.europaeaに比べアニーリング温度を10℃下げる必要があり、極めて多量の鋳型DNAを必要とした。このため、更に高感度で特異性の高いプライマーを設計し、Nested PCRを試みた。プライマーはamoに近縁のpmoを含めて増幅する組み合わせと、その内側のβ-Proteobacteriaのアンモニア酸化菌のamoに特異的な領域を標的としてより厳しい条件で増幅する組み合わせの2組を用いた。その結果、N.europaea及びN.multiformisの両者からフェムトグラムオーダーの鋳型DNA量から増幅産物が得られた。データベースに登録されたamoの塩基配列にみられる両者の増幅産物の差、約20bpはアガロースゲル電気泳動では区別できなかったが、特異的プローブを用いたサザンハイブリによりPCR産物の起源を識別できた。ここで設計したPCRプライマーを用いて、間接抽出法で得た土壌DNAを鋳型としてNested PCRを行い、amo遺伝子の検出を試みた。供試土壌はイチゴ栽培施設土壌で、アンモニア酸化菌密度は生土1g当たり4×10^4だった。土壌DNAを鋳型としても、純粋培養のN.europaeaDNAからと同じ位置に泳動されるバンドを得た。また、サザンハイブリによりN.europaeaのamoの特異的プローブとハイブリすることを確認した。

Since the time of application for this research project, several species of acidifying bacteria have been developed since then. (AMO) 缝子(amo)の塩综合がデータベースに登录されたので、suitable to useした.またこのため, application form of plan の一を cut love し, より前に入めた. N.europaeaATCC25978 and N.multiformis ATCC25196たDNAを鋳typeとして、N.europaeaのアンモニアモノオキシゲナThe ーゼののアミノacid sequencer base laboratory is designed by the したオリゴヌクレオチドをプライマーとしてPCRを行った. N.europaea's widening product has a large proportion of the base arrangement and is determined, and the reported N.europaea's base arrangement has an identity of 98%.また、N.multiformisからのincreasing productは、サザンハイプリのRESULTSこのBacteriaのamoにspecificなプローブとハイブリダイズした. N.multiformisN.euro It is necessary to use paea at a temperature of 10°C, and it is necessary to use a large amount of DNA type DNA at a temperature of 10°C.このため, にHigh sensitivity and specificity の高いプライマーをdesignし, Nested PCR をtestみた.プライマーはamoにNearly縁のpmoを合めてincreased width する组み合わせと、その内のβ-Proteobacteri aのアンモニアAcidifying bacteriaのamoにspecificなfieldをtargetとしてより厳しいconditionsでincreased widthするgroupみ合わせの2组を用いた. The results of N. europaea and N. multiformis were obtained by increasing the amount of type DNA.データベースに登录されたamoの塩婫みられる両者のincreasing product の difference, about 20bp はアガロースゲル电気The purpose of swimming is to distinguish the origin of PCR products, and to identify the origin of specific PCR products.ここでDesignしたPCRプライマーをUseいて、Indirect extraction methodでgetた壌DNAを鋳typeとしてNested PCRを行い、amo缝子の検出をtrialみた. The test soil and soil cultivation facilities are soil and the acidifying bacteria density of the soil is 1g, which is equivalent to 4 × 10^4. The N. europaea DNA of the soil type and the pure culture of N. europaea DNA are of the same position and the swimming movement is the same.また、サザンハイブリによりN.europaeaのamoのspecificプローブとハイブリすることをconfirmationした.