ニジマスGTリピートDNAを用いた魚類細胞への遺伝子導入ベクターの開発

使用虹鳟鱼 GT 重复 DNA 开发将基因导入载体导入鱼细胞

• 批准号: 07760176
• 负责人: 森 司
• 金额: $ 0.7万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07760176/
• 关键词: ニジマス; GTリピート; 遺伝子

マウスやショウジョウバエなどではトランスジェニックアニマルを作る方法がすでに確立されている。これに比べるとトランスジェニックフィシュの研究は研究年数も浅く、技術的にもまだ確立していない。近年、主にゼブラフィシュやメダカなどの小型魚類に外来遺伝子の導入を計った研究が急増しているが遺伝子導入、発現、時世代への遺伝と三拍子揃った成果を出したものは今のところほとんど報告されていない。一方、同じ遺伝子導入でも植物やショウジョウバエを用いた遺伝子導入ではかなりの確率で外来遺伝子の導入が可能であり、さらに、子孫にその形質を安定に伝えることが可能である。その仕組みとして、これらの生物では外来遺伝子導入ベクター内に染色体の塩基配列と相同な約25bpのダイレクトリピートが存在しており、この配列を用いて相同組換で遺伝子導入が行なわれている。そのため、魚類の多系分析に用いられているVNTRやGTリピートマイクロサテライト(染色体中に存在する特異的塩基配列で全ゲノムに均等に存在し、メンデル遺伝する事が知られている)の特異的塩基配列を市販のベクターに挿入しにニジマスの卵にマイクロインジェクションすることにより外来遺伝子を相同組換えにより染色体に導入することを試みた。方法として、GTリピート特異配列ライトアーム(AGATTTACCCAGCCAGGTAG)レフトアーム(CTGTCCCTGTTCAGACTATGT)でレポーター遺伝子を挟みベクターへ接続し卵にインジェクションした。このアームをベクターに接続する方式をセンスかアンチセンス、またはセンスとアンチセンスの3様式作成した。次に、インジェクションした卵の全てを擦り潰し、さらに遺伝子を抽出、レポーター遺伝子に特異的な配列を合成しPCR法により卵に外来遺伝子が導入できたか否かを調べた。その結果、レポーター遺伝子(CAT)の前後に二組のGTリピート特異配列を接合(センス、アンチセンス)した時の遺伝子導入効率は一組のGTリピート特異配列を接合した場合よりも卵への遺伝子導入効率が約15%増加した。

在小鼠，果蝇等中已经建立了创造转基因动物的方法。相比之下，转基因鱼类研究的数年数量最短，尚未在技术上建立。近年来，对外国基因引入的研究一直在迅速增加，主要是斑马鱼和Medaka等小鱼类，但是到目前为止，很少有报道能够取得所有三个结果：基因转移，表达和遗传性通过时间和世代。另一方面，即使使用相同的基因转移，在转染植物或果蝇时也可以很可能引入外源基因，并且有可能稳定地将特征传播到后代。作为这种机制，在这些生物体中，外国基因转移载体中存在与染色体核苷酸序列同源约25 bp的直接重复，并使用该序列通过同源重组进行基因转移。因此，我们试图通过将VNTR和GT重复的微卫星的特定核苷酸序列（在整个基因组中同样同样存在于染色体中存在的特定核苷酸序列）插入染色体，并将其用于Mendelian遗传的染色体），将其引入染色体的特定核苷酸序列，并将其用于Mickersecrone commercore vector。作为一种方法，将报告基因夹在GT重复特异性序列光臂（Agatttacccccagcagggtag）左臂（CTGTCCCCTGTTCAGACTATGT）之间，并将报告基因连接到载体，并注入了鸡蛋。创建了将此手臂连接到向量的三种方法：感官或反义，或感觉和反义。接下来，将所有注入的卵擦成粉碎，并提取基因，并合成对报告基因基因的序列，并使用PCR方法来确定是否可以将外源基因引入卵中。结果，与一组偶联的GT重复特定序列相比，当报告基因（CAT）之前和之后，将两组GT重复特定序列（siense，andsense）偶联时（有义，反义）时，基因转移效率提高了约15％。