ニジマスのスタニオカルシン遺伝子の発現と制御機構の解析

虹鳟鱼斯钙素基因表达及调控机制分析

• 批准号: 06760166
• 负责人: 森 司
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06760166/
• 关键词: スタニウス小体; スタニオカルシン; 遺伝子

ニジマスのスタニウス小体を取り出し、このスタニウス小体をグアニジンイソチアシアネートと酸性フェノールを用いてm-RNAを抽出し、さらにオリゴdtカラムを用いてポリ(A)RNAを抽出精製後λgt22Aを用いて約30万個のc-DNAライブラリーを作成した。又、既知のニジマス、スタニオカルシンのN末のアミノ酸配列に対応するDNA((1)AACTCCCCIGATGTIGC,(2)TGTGGIACITTTGCITGCCT)と20個のポリTをプライマーとして合成し、作成したc-DNAライブラリー100μlよりDNAを抽出し鋳型DNAとしてPCRを行った結果、(1)のプライマーで約2KbのDNAバンドを検出した。そのため、このPCR産物をTベクターに導入しシークエンスした結果、N末のアミノ酸配列の一部にシークエンスデーターが対応することからスタニオカルシン遺伝子と判断した。このPCR産物をプローブとしてc-DNAライブラリーより完全長のスタニオカルシンc-DNAをスクリーニングした結果、5個のクローンを選抜した。これらのクローンはお互いにに相同であることをプラークハイブリで確かめた。次に、このうちの一つのクローンの全塩基配列のシークエンスをした結果、263のアミノ酸配列を有する2153bpの遺伝子であった。この遺伝子は既知のウナギのスタニオカルシン遺伝子と80%の相同性を有し90%のアミノ酸相同性を有した。しかし、この遺伝子の発現をノーザンで調べた結果、ニジマスに10mMのCaClを注射したものとコントロールとでは有意な差が見られなかった。今後、この遺伝子を大腸菌で発現させ、精製したタンパクを用いた実験を試みる。

提取彩虹鳟鱼的Stanius体，并使用鸟胺异硫代和酸性苯酚从Stanius体中提取M-RNA，并使用寡素柱提取并纯化Poly（A）RNA，然后使用约300,000 C-DNA库，使用λGT22A进行大约300,000 c-DNA库。 Furthermore, 20 polyTs were synthesized using DNA corresponding to the N-terminal amino acid sequence of known rainbow trout and staniocalcin as primers ((1) AACTCCCCIGATGTIGC, (2) TGTGGIACITTTGCITGCCT) and 20 polyTs, and DNA was extracted from 100 μl of the created c-DNA library and PCR was performed as template DNA, and a用底漆（1）检测到大约2KB的DNA带。因此，将该PCR产物引入t载体并进行了测序，并且序列数据对应于N末端的氨基酸序列的一部分，因此确定它是staniocalcin基因。使用该PCR产物作为探针，从C-DNA文库中筛选了全长staniocalcin c-DNA，并选择了五个克隆。我们用斑块杂种确认这些克隆彼此同源。接下来，对这些克隆之一的整个碱基序列进行了测序，其结果是具有263个氨基酸序列的2153bp基因。该基因具有80％同源性和90％的氨基酸同源性，与已知的鳗鱼级别基因具有同源性。但是，当在北部检查了该基因的表达时，注射10 mM CaCl和对照的彩虹鳟鱼之间没有发现显着差异。将来，我们将尝试使用纯化的蛋白质在大肠杆菌和实验中表达该基因。