ニジマスのスタニオカルシン遺伝子の発現と制御機構の解析

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ニジマスのスタニウス小体を取り出し、このスタニウス小体をグアニジンイソチアシアネートと酸性フェノールを用いてm-RNAを抽出し、さらにオリゴdtカラムを用いてポリ(A)RNAを抽出精製後λgt22Aを用いて約30万個のc-DNAライブラリーを作成した。又、既知のニジマス、スタニオカルシンのN末のアミノ酸配列に対応するDNA((1)AACTCCCCIGATGTIGC,(2)TGTGGIACITTTGCITGCCT)と20個のポリTをプライマーとして合成し、作成したc-DNAライブラリー100μlよりDNAを抽出し鋳型DNAとしてPCRを行った結果、(1)のプライマーで約2KbのDNAバンドを検出した。そのため、このPCR産物をTベクターに導入しシークエンスした結果、N末のアミノ酸配列の一部にシークエンスデーターが対応することからスタニオカルシン遺伝子と判断した。このPCR産物をプローブとしてc-DNAライブラリーより完全長のスタニオカルシンc-DNAをスクリーニングした結果、5個のクローンを選抜した。これらのクローンはお互いにに相同であることをプラークハイブリで確かめた。次に、このうちの一つのクローンの全塩基配列のシークエンスをした結果、263のアミノ酸配列を有する2153bpの遺伝子であった。この遺伝子は既知のウナギのスタニオカルシン遺伝子と80%の相同性を有し90%のアミノ酸相同性を有した。しかし、この遺伝子の発現をノーザンで調べた結果、ニジマスに10mMのCaClを注射したものとコントロールとでは有意な差が見られなかった。今後、この遺伝子を大腸菌で発現させ、精製したタンパクを用いた実験を試みる。