大腸菌に発現させたヒト薬物代謝酵素のくすりの安全性評価への応用

大肠杆菌表达的人体药物代谢酶在药物安全性评价中的应用

基本信息

批准号：
07770306
负责人：
山崎浩史
金额：
$ 0.7万
依托单位：
Osaka Prefectural Institute of Public Health
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

薬物代謝酵素の中でも最も重要な酵素のひとつであるチトクロームP450酵素の活性発現には、NADPH-P450還元酵素が必須であるが、ヒト肝の主要分子種であるP4503A4酵素を用いる再構成系における活性発現条件については、混合リン脂質等を必要とするなど、他の分子種とは異なることが示唆されている。そこで、ヒトに対する化学物質の安全性評価を目的として、ヒトのリコンビナントP450酵素から、P4503A4と遺伝的多型性が報告されているP4503A5を選び、種々の条件下で薬物代謝活性を調べ、大腸菌の電子伝達系の利用の可能性についても検討した。活性発現条件を調べたところ、両酵素のニフェジピン酸化、テストステロン水酸化活性及びアフラトキシン代謝的活性化反応は、チトクロームb_5と塩化マグネシウムに大きく依存したが、エリスロマイシン及びエチルモルフィン脱メチル化反応ではこれらを要求しなかった(論文1-4)。大量に入手可能な大腸菌の上清画分から電子伝達系に関与するflavodoxinとflavodoxin還元酵素を精製し、ウサギ肝由来のNADPH-P450還元酵素と置換したところ、P4503A4に電子を供給して薬物酸化活性を発現させたが、その触媒作用は十分ではなかった。P4503A4遺伝子を導入した大腸菌を直接を用いてもテストステロン水酸化活性が弱いながら認められた(論文1)。以上の結果から、ヒトP4503A4/5酵素の薬物酸化反応には、基質によってチトクロームb_5と塩化マグネシウムが必須となることが認められた。またP4503A4酵素遺伝子導入大腸菌がバイオリアクターとして利用可能であることが示唆されたが、医薬品等の薬理活性や毒性を検討するためには、精製ヒトP450酵素を用いて至適条件で活性を再構成し、関与するP450酵素の特定(論文5)により、化学物質の代謝的活性化や薬物相互作用等を整理して理解することが必要である。

尽管NADPH-P450还原酶对于细胞色素p450酶的主动表达至关重要，这是药物代谢化酶中最重要的酶之一，但NADPH-P450还原酶是必不可少的，是必不可少的，是使用P4503A4酶的重新构造系统中的重新构造系统中的活性表达条件，与人类liver的主要分子相差不同，是与人liver中的主要分子相差不同的。等等。因此，为了评估人类化学物质的安全性，我们从人类重组P450酶中选择了P4503A4和P4503A5，这些P4503A4和P4503A5是遗传性多态性的，并检查了在各种条件下的药物代谢活性，还检查了使用E.Coli中电子传输系统的可能性。当检查活性表达的条件时，硝苯地平氧化，两种酶的睾丸激素羟基化活性和黄曲毒素代谢激活反应在很大程度上依赖于细胞色素B_5和氯化镁，但促甲霉素和乙基苯甲酸反应不需要这些（二甲基化反应）。从大肠杆菌的大部分上清液中纯化了参与电子传输系统的黄酮毒素和黄酮毒素还原酶，并由来自兔肝脏的NADPH-P450还原酶代替，并将电子提供给P4503A4以表达药物氧化活性，但催化剂不足。即使使用了直接转移到P4503A4基因的大肠杆菌，尽管弱度较弱，但仍观察到睾丸激素羟基化活性（论文1）。从上述结果中可以发现，根据底物，细胞色素B_5和氯化镁对于人P4503A4/5酶的药物氧化反应至关重要。还有人提出，已引入p4503a4酶的大肠杆菌可以用作生物反应器，但是为了研究药物的药理活性和药理学活动和毒性等，有必要使用纯净的人类p450酶（及其介绍p450 enzys）在最佳条件下重新构建活性，以确定参与的p450酶，并介绍了彼此的活动，并遍及p450酶，并遍及p450 Zymes，并遍及p450 Zymes（B450酶），遍及p450 Zymes gober ysborive ysbor Isbor Isbor ybotiles grom ysbor ysbor ysbor ysbor ysbor ysbor ysbor ysbor ysbor ysbor。化学物质，药物相互作用等。