大腸菌に発現させたヒト薬物代謝酵素のくすりの安全性評価への応用

大肠杆菌表达的人体药物代谢酶在药物安全性评价中的应用

• 批准号: 07770306
• 负责人: 山崎 浩史
• 金额: $ 0.7万
• 依托单位: Osaka Prefectural Institute of Public Health
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07770306/
• 关键词: チトクロームP450酵素; チトクロームb_5; 大腸菌; ヒト; CYP3A4; CYP3A5; フラボドキシン; リコンビナント

薬物代謝酵素の中でも最も重要な酵素のひとつであるチトクロームP450酵素の活性発現には、NADPH-P450還元酵素が必須であるが、ヒト肝の主要分子種であるP4503A4酵素を用いる再構成系における活性発現条件については、混合リン脂質等を必要とするなど、他の分子種とは異なることが示唆されている。そこで、ヒトに対する化学物質の安全性評価を目的として、ヒトのリコンビナントP450酵素から、P4503A4と遺伝的多型性が報告されているP4503A5を選び、種々の条件下で薬物代謝活性を調べ、大腸菌の電子伝達系の利用の可能性についても検討した。活性発現条件を調べたところ、両酵素のニフェジピン酸化、テストステロン水酸化活性及びアフラトキシン代謝的活性化反応は、チトクロームb_5と塩化マグネシウムに大きく依存したが、エリスロマイシン及びエチルモルフィン脱メチル化反応ではこれらを要求しなかった(論文1-4)。大量に入手可能な大腸菌の上清画分から電子伝達系に関与するflavodoxinとflavodoxin還元酵素を精製し、ウサギ肝由来のNADPH-P450還元酵素と置換したところ、P4503A4に電子を供給して薬物酸化活性を発現させたが、その触媒作用は十分ではなかった。P4503A4遺伝子を導入した大腸菌を直接を用いてもテストステロン水酸化活性が弱いながら認められた(論文1)。以上の結果から、ヒトP4503A4/5酵素の薬物酸化反応には、基質によってチトクロームb_5と塩化マグネシウムが必須となることが認められた。またP4503A4酵素遺伝子導入大腸菌がバイオリアクターとして利用可能であることが示唆されたが、医薬品等の薬理活性や毒性を検討するためには、精製ヒトP450酵素を用いて至適条件で活性を再構成し、関与するP450酵素の特定(論文5)により、化学物質の代謝的活性化や薬物相互作用等を整理して理解することが必要である。

Among the most important enzymes in the metabolism of chemicals, NADPH-P450 enzyme is essential for the activity of P450 enzyme, and P4503A4 enzyme is essential for the activity of P4503A4 enzyme in the recombination system of main molecular species of liver. For the purpose of safety assessment of chemicals, the polymorphism of P450 enzyme, P4503A4 and P4503A5 in the selection of P4503A5, the modulation of metabolic activity of chemicals under different conditions, and the possibility of utilization of electronic transmission systems of Escherichia coli were discussed. The activity development conditions are regulated by enzyme activity, enzyme acidification, enzyme hydration activity and enzyme metabolism. The activity development conditions are dependent on enzyme activity, enzyme hydrolysis activity and enzyme metabolism activity (Papers 1-4). A large number of E. coli supernatant molecules are involved in electron transfer systems, and flavodoxin and flavodoxin reducing enzymes are purified. The NADPH-P450 reducing enzymes from which the liver is derived are replaced by P4503A4, which is an electron donor and has a catalytic effect. P4503A4 gene was introduced into Escherichia coli directly and its acidifying activity was weak (Paper 1). The above results show that P4503A4/5 enzyme has the ability to react with enzymes and substrates. P4503A4 enzyme gene introduced into E. coli for possible use, indicating the biological activity and toxicity of pharmaceutical products, etc.(Paper 5), indicating the necessary understanding of the activity of P450 enzyme for reconstituting, regulating and metabolizing chemical substances.

项目成果

Imaoka, S. et al.: "Mutagenic activation of 3-methoxy-4-aminoazobenzene by mouse renal cytochrome P450 CYP4B1: Cloning and characterization of mouse CYP4B1." Arch. Biochem. Biophys.321. 255-262 (1995)

Imaoka, S. 等人：“小鼠肾细胞色素 P450 CYP4B1 对 3-甲氧基-4-氨基偶氮苯的诱变激活：小鼠 CYP4B1 的克隆和表征。”

Yamazaki, H. et al.: "Procarcinogen activation by cytochrome P450 3A4 and 3A5 expressed in Escherichia coli and by human liver microsomes." Carcinogenesis. 16. 2167-2170 (1995)

Yamazaki, H. 等人：“大肠杆菌中表达的细胞色素 P450 3A4 和 3A5 以及人肝微粒体激活原致癌物。”

Gillam, E. M. J. et al.: "Expression of cytochrome P450 3A5 in Escherichia coli: Effects of 5' modification, purification, spectral characterization,reconstitution conditions, and catalytic activities." Arch. Biochem. Biophys.317. 374-384 (1995)

Gillam, E. M. J. 等人：“细胞色素 P450 3A5 在大肠杆菌中的表达：5 修饰、纯化、光谱表征、重构条件和催化活性的影响。”