モルヒネ活性代謝物生成に関わるヒト肝グルクロン酸転移酵素のクローニングと発現

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麻薬性鎮痛薬モルヒネの活性代謝物の生成に関与する、ヒトのUDP-グルクロン酸転移酵素(UGT)について研究を行った。モルヒネの活性代謝物、モルヒネ-6-グルクロニド(M-6-G)の生成能には著しい種差がある。本研究では、モルモットとヒトがいずれもM-6-G生成能が高いことに着目した。モルモット肝には、M-6-G生成に関わっていると思われるUGT55Kが存在することから、ヒト肝にもM-6-G生成酵素がcounterpartとして存在するとの作業仮説を立てた。当教室では既にUGT55KのcDNAクローニングを行っていることから、これをプロープとして、ヒト肝のM-6-G生成UGTのcDNAクローニングを試みた。UGTは、isoform間で相同性が高いことから、多くのisoformのなかからM-6-G生成UGTのクローンを選択的に得るために、cDNAの配列のうち基質特異性の決定に重要と考えられる領域を選定し、この部分492dpをPCR増幅してプローブとした。プローブは、PCRによってフルオレセインラベルし、ヒト肝λgtllcDNAライブラリー(CLONTECH社)をスクリーニングした。3次スクリーニングまで行い、7個のポジティブクローンを得た。これらのクローンのインサートの長さは、それぞれ1.8kdp、1.5kbp(2個)、1.4kbp、1.3kbpおよび1.2kbpであった。現在、pUC119ベクターにサブクローニングを行ったところであり、制限酵素地図を作製し、DNAシークエンシングを行う段階まで進んでいる。全塩基配列を決定して、培養細胞で発現させるには至らなかった。UGTは、約530アミノ酸からなることから、その全長をエンコードするcDNAは、1.5kbp以上であると思われる。本研究で得られたクローンの中にも、全長のUGTをエンコードするものが含まれている可能性がある。