環境ホルモンコプラナーPCBによる細胞質チロシンホスファターゼの抑制メカニズム

内分泌干扰物共面PCB对细胞质酪氨酸磷酸酶的抑制机制

基本信息

批准号：
11770183
负责人：
石井祐次
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11770183/
关键词：
polychlorinated biphenyl dioxin carbonic anhydrase suppression phosphatase gene regulation liver apoptosis Carbonic anhydrase cDNA cloning muscle

项目摘要

環境ホルモンコプラナーPCBによる細胞質チロシンフォスファターゼ、肝臓型カルボニックアンヒドラーゼIII(CAIII)の抑制メカニズムを明らかにすることを目的として、まずCAIIIを高発現しておりラット肝臓由来の細胞を見出した。ラットH4IIE細胞はCAIIIの発現は高くなく、CAIIIの構成的な発現に必要な転写調節が行われていないと思われた。そこで、ラットより初代培養肝細胞を調製し、CAIIIの発現を調べると共に、3,3',4,4',5-pentachlorobiphenyl(PCB126)処理の影響も調べた。初代培養肝細胞におけるCAIIIの発現レベルは、in vivoに比べて低いものであったが、PCB126にレスポンスした発現抑制が認められた。このことから、初代培養肝細胞系が、PCB126によるCAIIIの発現抑制の研究に利用可能であると考えられた。次に、CAIIIの遺伝子発現調節領域をクローン化した。ヒトとマウスのCAIIIプロモーターの配列には、保存された領域があることから、ラットにおいても保存されている可能性があった。ラット肝臓からゲノムDNAを調製し、この配列を基にラットCAIIIプロモーターをPCR増幅した。PCR産物はダイレクトシーケンスによって配列を決定し、また、TA-cloningによって、subcloningを行った。得られたCAIII遺伝子の5'-上流域1.5kbの塩基配列を、モチーフ解析したところ、肝特異的に発現する遺伝子によく見られるCCAAT enhancer binding protein(C/EBP)結合エレメントと、xenobiotic responsive element(XRE)と呼ばれるAh-レセプター(AhR)に対する応答配列が独立して存在していた。

为了阐明抑制细胞质酪糖磷酸酶和肝碳酸酐酶III（CAIII）的机制，即环境激素共辉酮PCB，我们首先发现了表达CAIII的细胞，这些细胞表达CAIII并衍生自大鼠肝脏。大鼠H4IIE细胞没有太多表达CAIII，并且似乎没有针对CAIII的本构表达所需的转录调节。因此，从大鼠中制备原发性培养的肝细胞以检查CAIII的表达，并检查了用3,3'，4,4'，5-五氯苯基的治疗作用（PCB126）。尽管原代培养的肝细胞中的CAIII的表达水平低于体内，但观察到PCB126响应性抑制。这表明原发性培养的肝细胞系可用于研究PCB126对CAIII表达的抑制。然后克隆CAII的基因表达调节区域。由于有保守的区域，人类和小鼠CAIII启动子的序列也可以保守。从大鼠肝脏中制备基因组DNA，并根据该序列对大鼠CAIII启动子进行PCR。通过直接测序和亚克隆通过ta-cloning对PCR产物进行测序。因此，当在获得CAIII基因的5'上游区域的1.5 Kb核苷酸序列上进行基序分析时，在基因中特定表达的肝脏中通常发现的CCAAT增强子结合蛋白（C/EBP）结合元件的独立存在，而Ahrebector（AHR）（Xenob）（XenBiousious）（XenBiousious）（Xener）（Xeniob）。