メダカ孵化酵素遺伝子発現と孵化腺細胞の分化

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○メダカ孵化酵素遺伝子の発現調節機構。メダカ胚で孵化腺細胞特異的に発現するレポーター遺伝子の作成を目標とした。翻訳開始点よりメダカ孵化酵素遺伝子の上流域数キロbpを含むDNA断片の3'側にβガラクトシダーゼの構造遺伝子部分を孵化酵素遺伝子のATGに読み枠が一致するように接続したベクターを作成した。遺伝子導入はメダカ胚の1細胞期を用い顕微注入法により行った。具体的には、ベクターpMC1871よりβガラクトシダーゼの構造遺伝子部分を切り出しpBluescriptに挿入し、さらにLCE遺伝子上流3kbpを含む断片を,またHCE遺伝子(Hcele)の上流1.8kbを含む断片を挿入した。出来上がったベクター中のレポーター遺伝子部分を制限酵素で切りだし、精製後、顕微注入法により遺伝子導入した。適当なステージまで発生させ固定後、酵素の発色により遺伝子発現を観察した。結果は、上記の2種のベクターでは、遺伝子の発現は見られなかった。なお、SV40のプロモーター、エンハンサーでは遺伝子発現が見られることより、インジェクション法に問題があるとは考えられず、挿入した遺伝子断片中に、孵化酵素遺伝子発現に必要十分なcis-調節領域が含まれていないことが予想される。現在、新たな遺伝子断片を含むレポーター遺伝子を作成中である。○孵化線細胞の分化のタイミングゼブラフィシュのク-スコイドcDNAを用いメダカ胚cDNAライブラリーをスクリーニングしてメダカグ-スコイドcDNAをクローン化した。whole mount in situハイブリダイゼーションの結果、グ-スコイド遺伝子は初期嚢胚期でオ-ガナイザー領域で発現が見られ、後期嚢胚期では主に体軸の前方で発現している。体節形成期において孵化酵素遺伝子とグ-スコイド遺伝子の発現を2重染色法により検出すると一致した細胞で発現が見られる。このことは、孵化線細胞の前駆細胞がオ-ガナイザー領域に存在することを示唆している。