メダカ孵化酵素遺伝子の解析

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本研究課題において目的とした以下の3つの点に関して述べる。(1)孵化酵素遺伝子の発現と腺細胞の分化:申請者らはメダカ孵化酵素の2成分、HCEとLCE、に特異的な抗体を用いて発生過程における酵素タンパク質の形成をしらべ、両成分ならびにそのプロ酵素のタンパク質が発生第2日目に検出できることを確かめた。これらは同一分泌顆粒中に含まれる。さらにHCEとLCEのcDNAのクローニングを行い、その断片をプローブとして発生過程における胚からのRNA抽出物のノザン分析を行った。その結果、遺伝子発現は発生第2日(レンズ形成初期)に起り第3日にかけて急激に活発化することが判明した。すなわち、遺伝子発現後たゞちに翻訳されることが判った。(2)HCE及びLCEの比較分子生物学的研究:両者のcDNAクローンの分析を行い、LCEとHCEはともに20アミノ酸のシグナルペプチドをもち、51および50のアミノ酸から成るプロペプチドを有し、ともに200アミノ酸の成熟ペプチドから成るプレプロ酵素として合成されることが判った。両成熟酵素のアミノ酸配列のホモロジーは55%である。両酵素ともにその活性中心と考えられる共通配列の構造は酷似しており、Znを配位するヒスチジンを含む5残基はコラゲナーゼなどの細胞間質分解金属プロティナーゼの共通配列と同一である。さらにこの5残基を含む12アミノ酸残基はアスタシン族と呼ばれるZn-プロテアーゼの活性中心の構造と同じである。なお、孵化腺細胞内にあるプロ酵素から分泌時に成熟型酵素に活性化されるが、この過程はEDTAにより粗害されるので、おそらく自己触媒的に起ると考えられる。(3)ゲノムDNAの構造解析:cDNA断片をプローブとしてHCE、LCEのゲノムDNAをクローン化した。LCEは7つのイントロンをもつ構造であるがHCEはイントロンがなく、複数の遺伝子が縦列している。