筋肉組織におけるカルパイン遺伝子の発現制御に関する分子遺伝学的研究

目的:カルパインはシステイン・プロテアーゼの一種であり、筋肉組織においては、筋繊維蛋白質の分解に重要な役割を演じていると考えられている。本研究では、ウズラのカルパイン遺伝子の発現制御について、遺伝子レベルからの解析を行うことを目的として、ウズラ・カルパイン遺伝子のクローニングを行い、その構造解析を試みた。方法:無作為交配集団(RR)系統のウズラの浅胸筋からtotal RNAを抽出し、オリゴ(dT)セルロースカラムでpoly(A)^+RNAを精製した。poly(A)+RNAを鋳型とし、逆転転写酵素を用いて1st strand cDNAを合成し、これを鋳型にしてPCR法でDNAを増幅させた。プライマーはニワトリ・カルパインcDNAをもとにデザインされた。得られたPCR産物はlacz遺伝子を持つp123Tベクターにクローニングした。塩基配列はA.L.F.DNAシークエンサーで解析した。結果:1)アガロースゲル電気泳動でcDNAの5'側より104bp、630bpのPCR産物が確認された。2)1041bp insertを含むプラスミドベクターは、EcoRVで3つの断片(297bp、303bp、441bp)に分けられた。3)5'側より1041番目までの塩基配列が決定された。ニワトリのカルパイン遺伝子と比較すると、39個(38コドン)の塩基置換が見られ、このうち33個(85%)はtransitionで、6個はtransversion(15%)であった。4)アミノ酸配列では6箇所で置換が見られ、ウズラとニワトリとの相同性は98.3%であり、ヒトとは74.1%であった。5)これらの領域はカルパインの4つのドメインのうち、ドメインIとドメインIIであった。

目的:カルパインはシステイン・プロテアーゼの一種であり、筋肉組織においては、筋繊維蛋白質の分解に重要な役割を演じていると考えられている。本研究では、ウズラのカルパイン遺伝子の発現制御について、遺伝子レベルからの解析を行うことを目的として、ウズラ・カルパイン遺伝子のクローニングを行い、その構造解析を試みた。方法:無作為交配集団(RR)系統のウズラの浅胸筋からtotal RNAを抽出し、オリゴ(dT)セルロースカラムでpoly(A)^+RNAを精製した。poly(A)+RNAを鋳型とし、逆転転写酵素を用いて1st strand cDNAを合成し、これを鋳型にしてPCR法でDNAを増幅させた。プライマーはニワトリ・カルパインcDNAをもとにデザインされた。得られたPCR産物はlacz遺伝子を持つp123Tベクターにクローニングした。塩基配列はA.L.F.DNAシークエンサーで解析した。結果:1)アガロースゲル電気泳動でcDNAの5'側より104bp、630bpのPCR産物が確認された。2)1041bp insertを含むプラスミドベクターは、EcoRVで3つの断片(297bp、303bp、441bp)に分けられた。3)5'側より1041番目までの塩基配列が決定された。ニワトリのカルパイン遺伝子と比較すると、39個(38コドン)の塩基置換が見られ、このうち33個(85%)はtransitionで、6個はtransversion(15%)であった。4)アミノ酸配列では6箇所で置換が見られ、ウズラとニワトリとの相同性は98.3%であり、ヒトとは74.1%であった。5)これらの領域はカルパインの4つのドメインのうち、ドメインIとドメインIIであった。