軟骨組織におけるRGD構造を持つコラーゲン結合蛋白(RGD-CAP)の発現と機能

RGD结构胶原结合蛋白(RGD-CAP)在软骨组织中的表达及功能

• 批准号: 08672126
• 负责人: 能城 光秀
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Hiroshima University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08672126/
• 关键词: コラーゲン; インテグリン認識部位; 軟骨基質; クローニング; 軟骨組織培養; 細胞接着

本研究は,コラーゲンと細胞の相互作用を仲介する蛋白としてのRGD-CAPの役割探求を目的としており,今年度までに以下のことを明らかにした。(1)ニワトリ胸骨軟骨cDNAライブラリーからRGD-CAPの完全長cDNAを単離し,全塩基配列を決定した。ニワトリRGD-CAPのcDNAは680個のアミノ酸に翻訳され,4つの繰り返し構造を持ち,またC端近傍にはインテグリン認識部位であるRGD配列が存在した。(2) cDNAを発現ベクターpET-28に組み込み、大腸菌を形質転換した後、RGD-CAP蛋白を発現させ,それを精製後、マウスに免役し抗体を作製した。(3)この抗血清を用いたWestern blot法によってニワトリ胸骨軟骨培養細胞について調べた結果、Conditioned Medium中でのRGD-CAP量はTGF-β添加により経時的に増加し,先にブタ軟骨細胞で観察されたTGF-βによるmRNAの増加と一致した。ニワトリ胚の頚椎において軟骨が分化する過程でRGD-CAPは基質形成層から肥大層にかけて多く分布していた。(4)ウサギ胸骨軟骨細胞培養Conditioned Mediumをrecombinant RGD-CAP-カラムにかけ,4M尿素での溶出画分に含まれる蛋白質の分子量およびアミノ末端配列を解析したところ,コラーゲン以外にもオステオネクチンに結合することが示唆された。(5) recombinant RGD-CAPをコートしたシャーレ上にウサギ関節軟骨細胞を播種し、伸展に対する影響と初期接着に対する影響を検討したところ,軟骨細胞の伸展及び初期接着は促進された。また,I型、II型,III型,V型コラーゲンの共存はRGD-CAPの作用を増強した。これらの作用はEDTAで阻害され、2価の金属イオンにより亢進し,RGD-CAPの細胞接着及び細胞伸展促進作用はインテグリンを介すると推察された。

This study は コ ラ ー ゲ ン と cells の interaction を placement す る protein と し て の RGD - CAP cut の service to explore を と し て お り, our ま で に following の こ と を Ming ら か に し た. (1) ニ ワ ト リ sternum cartilage cDNA ラ イ ブ ラ リ ー か ら RGD - CAP の completely cDNA を 単 し, salt base full column を decided し た. ニ ワ ト リ RGD - CAP の cDNA は 680 の ア ミ ノ acid に turn 訳 さ れ, 4 つ の Qiao り return し tectonic を ち to have, ま た C end nearly alongside に は イ ン テ グ リ ン know parts で あ る RGD match column が exist し た. (2) cDNA を 発 now ベ ク タ ー pET - 28 に group み 込 み, coliform を form quality planning in し た, RGD - CAP protein after を 発 now さ せ, そ れ を after refining, マ ウ ス に immune antibody を し cropping し た. (3) こ の antiserum を with い た Western blot method に よ っ て ニ ワ ト リ sternum cartilage cultured cells に つ い て adjustable べ た results and Conditioned In Medium で の RGD - CAP amount は TGF - beta added に よ り 経 に raised plus し, first に ブ タ chondrocytes で 観 examine さ れ た TGF - beta に よ る mRNA の rights and consistent と し た. ニ ワ ト リ embryo の 頚 vertebral に お い が て cartilage differentiation す る process で RGD - CAP は matrix cambium か ら hypertrophy layer に か け て く distribution more し て い た. (4)ウサギ sternal chondrocyte culture Conditioned Mediumをrecombinant RGD - CAP - カ ラ ム に か け, 4 m urea で の dissolution draw points に containing ま れ の る protein molecular weight お よ び ア ミ ノ ends with column を parsing し た と こ ろ, コ ラ ー ゲ ン outside に も オ ス テ オ ネ ク チ ン に combining す る こ と が in stopping さ れ た. (5) recombinant RGD - CAP を コ ー ト し た シ ャ ー レ on に ウ サ ギ masato section chondrocytes を seeding し, stretching に す seaborne る influence と early then に す seaborne る influence を beg し 検 た と こ ろ, cartilage cell の stretch and then は promote early び さ れ た. Youdaoplaceholder0, type I, type II, type III, and type V コラ ゲ ゲ <s:1> <s:1> coexist, and <s:1> RGD-CAP <e:1> effects を enhance た. こ れ ら の role は EDTA で resistance against さ れ, 2 価 の metal イ オ ン に よ り hyperthyroidism し, RGD - CAP then and び の cells extend promote は イ ン テ グ リ ン を interface す る と push examine さ れ た.

项目成果

Hashimoto, K.et al.: "Characterization of a cartilage-derived 66-kDa protein (RGD-CAP/ βig-h3) that binds to collagen" Biochem.Biophys.Acta. (in press). (1997)

Hashimoto, K. 等人：“与胶原蛋白结合的软骨衍生的 66-kDa 蛋白 (RGD-CAP/βig-h3) 的表征”Biochem.Biophys.Acta（出版中）。

Nakamura, S.et al.: "Enhancement of SPARC/Osteonectin Synthesis in Arthristic Cartilage, Its Increase Levels in Synovial Fluids from Patients with Reumatoid Arthritis, and Regulation by Growth Factors and Cytokines" Arthritis and Reumatism. 39. 539-551 (1

Nakamura, S.et al.：“关节炎软骨中 SPARC/骨连接素合成的增强，其在类风湿性关节炎患者滑液中的水平增加，以及生长因子和细胞因子的调节”关节炎和风湿病。

Okimura, A.et al.: "Cartilage-Matrix Protein (CMP) Synthesis is Enhanced in Arthritic Cartilage" Arthritis and Reumatism. (in press). (1997)

Okimura, A. 等人：“关节炎软骨中软骨基质蛋白 (CMP) 合成得到增强”关节炎和风湿病。

Yoshida, Y.et al: "Sterol 14-Demethylase P450 Activity Expressed in Rat Gonads : Contribution to the Formation of Mammalian Meiosis-Activating Sterols" Biochem.Biophys.Res.Commun.223. 534-538 (1996)

Yoshida, Y.等人：“大鼠性腺中表达的甾醇 14-脱甲基酶 P450 活性：对哺乳动物减数分裂激活甾醇形成的贡献”Biochem.Biophys.Res.Commun.223。

Jikko, A.et al.: "Effects of Cyclic Adenosine 3',5'-Monophosphate on Chondrocyte Terminal Differentiation and Cartilage-Matrix Calcification" Endocrinol.137. 122-128 (1996)

Jikko, A. 等人：“环腺苷 3,5-单磷酸对软骨细胞终末分化和软骨基质钙化的影响”Endocrinol.137。