G蛋白共役型受容体の細胞内局在の分子機構

G蛋白偶联受体细胞内定位的分子机制

• 批准号: 08672555
• 负责人: 辻本 豪三
• 金额: $ 1.54万
• 依托单位: National Research Institute for Child Health and Development
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08672555/
• 关键词: Green Fluorecent Protein; α1bアドレナリン受容体; マウスαT3細胞; Cキナーゼ

【目的】薬物受容体の薬物感受性の変化を起こす要因として、受容体の細胞内局在の変化が示唆されている。近年、発光クラゲより強い蛍光を有するGreen Fluorecent Protein(以下GFP)が単離クローニングされた。このGFPは、他の標的蛋白との融合が容易に行え、いろいろな生物学の分野で用いられ、特に機能蛋白の細胞内局在・移動に関して知見が得られ始めている。今年度、交感神経α1受容体をモデルに、GFP融合受容体を作製・発現させた細胞での薬物刺激による受容体局在の変化に及ぼす情報伝達機構の検討を行った。【研究方法】α1b受容体C端にGFP遺伝子を融合させたキメラ受容体を作製した。このキメラ受容体遺伝子をα1受容体を発現していないマウスαT3細胞に発現させ、得られた安定発現細胞集団を実験対象に用いた。レーザー共焦点顕微鏡を用い、薬物投与における局在の変化とカルシウムの変化の同時記録を行った。【結果】細胞表面に一致して強い蛍光シグナルが観察され、α1b受容体は定常状態では細胞膜表面にその大多数が局在していると考えられた。一方、ノルアドレナリン刺激により受容体蛋白の細胞内移行が認められ、が30〜40%の受容体が細胞内へ移行した。α1bアドレナリン受容体internalizationを各種薬物ツール(TPA、タプシガ-ジン、PLC阻害剤等)にて薬理学的解析を行い、Cキナーゼが重要な役割を担っていることが示唆された。【考察並びに結論】これまで不明であった細胞内局在による機能調節を調べる上で、特異抗体の作製・機能蛋白の細胞内局在の変化をリアルタイムでモニターすることは困難であった。しかし、今回試みたGFP融合による機能蛋白の標識技術を利用することにより生細胞での機能蛋白の局在・移動をリアルタイムで記録することが可能となった。今後このGFP融合による機能蛋白の標識技術を応用し、薬剤感受性の変化などにおける受容体蛋白の細胞内局在の影響などを検討する予定である。

[Objective] The main reasons for the change of drug receptor sensitivity and the change of receptor intracellular structure were discussed. In recent years, the Green Fluorescent Protein(hereinafter GFP) has been developed as a single protein. The fusion of GFP and other target proteins is easy to carry out, and the separation of biological fields is used, and the intracellular location of specific functional proteins is related to the movement of knowledge. This year, the receptor of sympathetic α1 gene, GFP fusion receptor, production and development of cell, chemical stimulation, receptor development and information transmission mechanism were discussed. [Method] GFP gene fusion at C-terminal of α1b receptor was controlled by α1b receptor. The α1 receptor is found in αT3 cells, and the αT3 receptor is found in αT3 cells. The confocal microscope is used in the process of transformation and simultaneous recording. [Results] The uniform and strong fluorescent light on the cell surface can be observed, and the α1b receptor is in a steady state but most of it is present on the cell membrane surface. The intracellular migration of receptor proteins was recognized by the stimulation of receptor proteins, and 30 ~ 40% of the receptor proteins migrated into the cells.α1b is a kind of compound (TPA, TPA, PLC, etc.), which is an important component of receptor internalization. [Investigation and Conclusion] It is difficult to regulate the function of specific antibodies in the intracellular regulation of functional proteins. However, this time we tried to use the labeling technology of functional proteins in GFP fusion, which makes it possible to record the location and movement of functional proteins in living cells in a real-time manner. In the future, the identification technology of functional proteins in GFP fusion will be used, and the effects of receptor protein on intracellular functions will be discussed.

项目成果

Shibata K,et.al.: "α_<1a>-Adrenoceptor polymorphism : pharmacological characterization and association with benign prostatic hypertrophy." Bri.J.Pharmacol.118. 1403-1408 (1996)

Shibata K 等人：“α_<1a>-肾上腺素受体多态性：药理学特征及其与良性前列腺肥大的关联。”Bri.J.Pharmacol.118（1996）。

Yazawa,H., et al.: "Oxytocin receptors are expressed and coupled to Ca2+ signaling in a human vascular smooth muscle cell line"Brit. J. Pharmacol.. 117. 799-804 (1996)

Yazawa, H., et al.：“催产素受体在人血管平滑肌细胞系中表达并与 Ca2 信号传导偶联”Brit。

Nasu.K., et al.: "Quantification and distribution of α1-adrenoceptor subtype mRNAs in human prostate : comparison of benign hypertro phied tissues and non-hypertrophied tissue"Bri.J.Pharmacol.. 119. 797-803 (1996)

Nasu.K.等人：“人前列腺中α1-肾上腺素受体亚型mRNA的定量和分布：良性肥大组织和非肥大组织的比较”Bri.J.Pharmacol.. 119. 797-803 (1996)