腸内細菌のビタミンB_<12>生合成に関与するアスパラギン酸脱水素酵素の精製

本研究は、腸内細菌のうち良好はビタミンB_<12>合成菌である。Klebsiella pneumoniae IFO 13541菌株によるアスパラギン酸脱水素酵素の証明のために、酵素の精製を研究の目的とした。1.供試菌株の培養条件と酵素活性との関係本菌株の好気培養においては、本酵素の活性は見られなかった。菌体の培養を目的として当初好気培養での菌体の生産を謀って後、嫌気培養を行った結果、酵素の活性がみられた。しかしながら、菌体の生産は低いが酵素の活性が高かったのは嫌気培養での生育であった。すなわち、本菌株におけるアスパラギン酸脱水素酵素は嫌気下においてのみ生産されることがわかった。2.酵素の精製(1)精製方法の検討補酵素をNADまたはNADPを必要とするので、各種の色素リガンドをしらべた結果、唯一Greenセファロースに吸着したこと、種々のイオン交換カラムでしらべた結果では、また唯一DEAE-Bio-Gelにのみ吸着がみられた。PAGEでの結果からは、いまだNADおよびNADPを補酵素とする数種の活性バンドがみられのでゲル濾過等との組み合わせを行って、今後さらに酵素の精製が残されている。(2)酵素の安定性失活しやすい酵素で、精製に苦心した。検討の結果、2-mercaptoethanolやDTTなどの還元剤の効果とMg,Co,Mnなどの金属イオンの賦活作用が分かった。

本研究は、腸内細菌のうち良好はビタミンB_<12>合成菌である。Klebsiella pneumoniae IFO 13541菌株によるアスパラギン酸脱水素酵素の証明のために、酵素の精製を研究の目的とした。1.供試菌株の培養条件と酵素活性との関係本菌株の好気培養においては、本酵素の活性は見られなかった。菌体の培養を目的として当初好気培養での菌体の生産を謀って後、嫌気培養を行った結果、酵素の活性がみられた。しかしながら、菌体の生産は低いが酵素の活性が高かったのは嫌気培養での生育であった。すなわち、本菌株におけるアスパラギン酸脱水素酵素は嫌気下においてのみ生産されることがわかった。2.酵素の精製(1)精製方法の検討補酵素をNADまたはNADPを必要とするので、各種の色素リガンドをしらべた結果、唯一Greenセファロースに吸着したこと、種々のイオン交換カラムでしらべた結果では、また唯一DEAE-Bio-Gelにのみ吸着がみられた。PAGEでの結果からは、いまだNADおよびNADPを補酵素とする数種の活性バンドがみられのでゲル濾過等との組み合わせを行って、今後さらに酵素の精製が残されている。(2)酵素の安定性失活しやすい酵素で、精製に苦心した。検討の結果、2-mercaptoethanolやDTTなどの還元剤の効果とMg,Co,Mnなどの金属イオンの賦活作用が分かった。