蛋白間相互作用に基づく遺伝子の機能的診断法の開発

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1. ADE2レポーター遺伝子を用いたストップコドンアッセイの臨床応用。APCのcDNAは全長8.5kbあるので、これを5つの領域に分けてアッセイ系を作製した。領域IとIIはRNAを、領域III.IV,Vは主にゲノムDNAを用いた。大腸癌では23例中12例(52%)が、乳癌では70例中14例(20%)が異常と診断され塩基配列の決定により全例に変異が証明された。この他に肺癌の1例にN℃遺伝子の変異が証明された。変異クローンの存在を示す赤い酵母コロニーは、10-50%の比率であった。2. 新しい癌抑制遺伝子のクローニングとその遺伝子変異の検出系の作製。LacZ遺伝子をレポーターとして使用する従来の酵母two-hybrid法を改良して、ADE2遺伝子をレポーターとする高感度の酵母two-hybrid法を用いて新しい癌抑制遺伝子候補AIE-75とAIEBPをクローニングすることに成功した。これらのcDNAをuniversal stop codonassay用に開発したベクターの,ADE2レポーター遺伝子に連結して遺伝子変異のアッセイ系を作製し、臨床材料において変異の有無を現在検索中である。3. 酵母アッセイの一つとしてdominant negative変異のアッセイ系を作製した。これは野生型p53と変異型p53を同時に酵母にtransformしてどちらの形質が発現するかを見るものである。グリオーマでは、dominant negative変異を持つ場合30歳台で発症するのに対してresessive変異では50歳台に発症することが明らかとなった。このアッセイ法の開発のために我々は、従来用いられた2μmの複製開始点を酵母セントロメア配列を含むCEN-ARSの複製開始点に変更した。そして色彩として表示させるためにアデニン代謝遺伝子であるADE2遺伝子をレポーターとして組み込んだ。この結果、two-hybrid法cDNAクローニングからその遺伝子診断までを一貫した行程で作製することに成功した。