ヒト細胞の増殖分化を調節するホメオボックス遺伝子の解析とその蛋白に対する抗体作製

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1.ヒトホメオボックス遺伝子の解析:DNAポリメラ-ゼδ補助蛋白(PCNA)の発現がホメオボックス蛋白で制御されていることをショウジョウバエの系で証明したので、次にこれをヒトの系において証明することを試みた。第2染色体のPCNA遺伝子に隣接するHox4BのcDNAをプロ-ブとしてHox4Bから3方向へ20kb離れたHox4A遺伝子をコスミドライブラリ-から単離し、pUC119にサブクロ-ニングした。ホメオドメインを中心にその前後約5000bpの塩基配列を決定し、ホメオボックス蛋白で強く保存されているアミノ酸配列(N末端側:IYPWM、C末端側:61アミノ酸のホメオドメイン)を基にその全アミノ酸配列を決定した。その結果、この遺伝子は2つのエクソンから成り、その間に2000bpのイントロンがある。コ-ドすると考えられるアミノ酸は全部で416個で、通常のホメオボックス蛋白よりC末端側に70ー100個アミノ酸が多い。61個のアミノ酸から成るホメオドメインを種々の種のホメオドメインと比較したところ、Hox4Aはショウジョウバエには無く、ヒトやマウスの哺乳類でのみ見出されているホメオドメインであり、ヒト第17染色体にあるHox2Gと高いホモロジ-を持つことが明らかになった。この遺伝子が胚発生のおよび細胞分化のどの場所あるいは段階で発現しているかについての検索が今後の課題である。2.ホメオボックス蛋白の大腸菌における発現:Hox4BとHox4Aのホメオドメイン蛋白を発現させて抗体を作製する目的で、ホメオボックス4Bのホメオドメイン183bpを含む360bp断片をBluescript IIに挿入した。次にホメオボックス4BのcDNA全体をpKK233ー2に挿入した。組替えたプラスミドでトランスフォ-ムしたクロ-ンを解析したところすべてホメオドメインを欠損したクロ-ンであった。現在、産生蛋白が大腸菌の外へ分泌される発現ベクタ-への組替え実験を行なっている。