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PDIファミリー蛋白質のシャペロン機能に関する研究

PDI家族蛋白的伴侣功能研究

基本信息

批准号：
10172232
负责人：
佐賀信介
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Aichi Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

Protein Disulfide Isomerase(PDI)とそのファミリー蛋白質(ERp61,ERp72など)はER内での蛋白質のS-S結合形成に関与している酵素であるが、PDIについては分子シャペロンとして働くことを示唆する報告がある。本研究ではPDIファミリー蛋白質のうちERp72のシャペロン機能を解析することを目的に、ERp72のペプチド結合ドメインを同定することを試みた。マウスERp72のcDNAに変異を加えて、段階的にC末端側を削除したdeletion mutantcDNAsを作製し、histidine tagsを持った蛋白としてそれぞれのmutantsをE.coliで発現させ、精製した。これらについて、還元変性凝集したインスリン・ペプチドへの結合能を解析したところ、full sizeのwild rERp72は約10%がインスリン凝集ペプチドに結合し、ラット肝マイクロゾーム分画より精製したnative ERp72と同程度のペプチド結合能を示した。C末端側より59、80、115残基を欠失させたdelution mutant rERp72もwild rERp72と同程度のペプチド結合能を示した。一方、150残基を欠失させたdelution mutantは、予想に反してほぼ100%がインスリン凝集ペプチドに結合した。さらに欠失を266残基にまで拡大すると、ペプチド結合能は50%程度に減少した。より欠失を大きくしたdelution mutantはまだ作製されていないため、完全に結合性が失われてしまうdeletionがどの部位か決定されていないが、この結果は、2番目と3番目のthioredoxin domainsの間の領域にペプチド結合に関与するdomainが存在し、C末端側の領域がこれを抑制的に制御していると解釈できる。しかしながら、deletionによる疎水性領域の露出などの影響も考慮する必要があるため、蛋白分解酵素を用いた限定分解によるdomain解析を行っている。

Protein Disulfide Isomerase(PDI) and Protein (ERp61,ERp72) are reported to be enzymes involved in protein S-S binding formation in ER, PDI and protein molecules. In this study, we analyzed the function of PDI protein and ERP72 protein. The cDNA of ERp72 was amplified and deleted from the C-terminal side of the fragment. Mutants of E.coli were produced and refined. The binding energy of the native ERp 72 is about 10% of the binding energy of the native ERp 72. C-terminal residues 59, 80 and 115 are missing and the mutation mutant rERp 72 and wild rERp72 are also missing. One residue, 150 residues, is missing. The mutation is expected to be 100% defective. The missing residue 266 was reduced by 50%. The deletion mutant is not only restricted by the presence of deletion domain, but also restricted by the presence of deletion domain in the region between 2 and 3 Thioretoxin domains. The analysis of protein decomposition domain is necessary for the determination of protein content.