カルモデュリン依存性蛋白質燐酸化反応による神経栄養因子産生の調節に関する研究

钙调素依赖性蛋白磷酸化反应调节神经营养因子产生的研究

基本信息

批准号：
10176228
负责人：
山本秀幸
金额：
$ 1.02万
依托单位：
Kumamoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

脳由来神経栄養因子(BDNF)は特定の神経細胞に対して強い生存維持活性を持つことが知られている。また、小脳の顆粒細胞では核内のCa^<2+>濃度の上昇により、BDNFの発現が著明に増強される。すなわち、核内のCa^<2+>/カルモデュリン依存性蛋白質燐酸化酵素(CaMキナーゼ)のBDNFの発現への関与が示唆される。平成9年度にCaMキナーゼIIのデルタサブユニットに対する特異抗体を用いて、本サブユニットが小脳の顆粒細胞の核内に存在することを見出した。さらに、RT-PCR法により核内移行シグナルをもつアイソフォームであるデルタ3のcDNAを小脳から単離することに成功した。今回、デルタ3をNG108-15細胞に過剰発現させ、BDNFの遺伝子発現に対する影響について検討した。1)小脳とNG108-15細胞では、BDNFのmRNAの中でエキソンIVを含むBDNF(IV-BDNF)のmRNAが多量に発現していた。2)定量PCR法による検討では電位依存性Ca^<2+>チャネルを開口させるBay-K8644の処理により、III-BDNFとIV-BDNFのmRNAが増加した。3)デルタ3の過剰発現によりIV-BDNFのmRNAの増加のみが有意に増強された。4)デルタ3のATP結合部位のアミノ酸を置換させ、活性をもたない変異体を作製した。得られた変異体の過剰発現ではIV-BDNFのmRNAの発現増強は認められなかった。5)免疫染色法によりBDNF蛋白質の発現について検討した。核内にデルタ3を過剰発現する細胞の細胞質のみがBDNFに対する抗体で強く染色された。今回の結果から、神経細胞でのBDNFの発現に核内に存在するCaMキナーゼIIが関与することが明らかになった。今後、ルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子としてBDNFプロモーターの転写活性を測定する予定である。

已知脑衍生的神经营养因子（BDNF）对特定的神经元具有强大的生存维持活性。此外，在小脑颗粒细胞中，通过核中Ca^<2+>的浓度增加，BDNF的表达显着增强。也就是说，这表明核涉及Ca^<2+>/钙调蛋白依赖性蛋白磷酸化酶（CAM激酶）参与BDNF的表达。在1997年，我们发现该亚基存在于小脑细胞核中，使用了针对CAM激酶II的三角洲亚基的特异性抗体。此外，我们成功地从RT-PCR的小脑中分离了Delta 3的cDNA，这是一种带有核转运信号的同工型。在本文中，Delta 3在NG108-15细胞中过表达，并研究了BDNF对基因表达的影响。 1）在小脑和NG108-15细胞中，在BDNF的mRNA中表达了含有外显子IV的BDNF（IV-BDNF）的大量mRNA。 2）在定量PCR研究中，打开电压依赖性Ca^<2+>通道的Bay-K8644处理增加了III-BDNF和IV-BDNF的mRNA。 3）Delta3的过表达显着增加了IV-BDNF中mRNA的增加。 4）替换Delta 3的ATP结合位点的氨基酸以产生非活性突变体。所得突变体的过表达未显示IV-BDNF mRNA的表达增强。 5）通过免疫染色研究了BDNF蛋白的表达。仅用抗BDNF的抗体对过表达三角洲3的过表达三角洲3的细胞细胞质被强烈染色。目前的结果表明，核中存在的CAM激酶II参与神经元中BDNF的表达。将来，我们计划使用荧光素酶基因作为记者基因来测量BDNF启动子的转录活性。