カルモデュリン依存性蛋白質燐酸化反応による神経栄養因子産生の調節に関する研究

脳由来神経栄養因子(BDNF)は特定の神経細胞に対して強い生存維持活性を持つことが知られている。また、小脳の顆粒細胞では核内のCa^<2+>濃度の上昇により、BDNFの発現が著明に増強される。すなわち、核内のCa^<2+>/カルモデュリン依存性蛋白質燐酸化酵素(CaMキナーゼ)のBDNFの発現への関与が示唆される。平成9年度にCaMキナーゼIIのデルタサブユニットに対する特異抗体を用いて、本サブユニットが小脳の顆粒細胞の核内に存在することを見出した。さらに、RT-PCR法により核内移行シグナルをもつアイソフォームであるデルタ3のcDNAを小脳から単離することに成功した。今回、デルタ3をNG108-15細胞に過剰発現させ、BDNFの遺伝子発現に対する影響について検討した。1)小脳とNG108-15細胞では、BDNFのmRNAの中でエキソンIVを含むBDNF(IV-BDNF)のmRNAが多量に発現していた。2)定量PCR法による検討では電位依存性Ca^<2+>チャネルを開口させるBay-K8644の処理により、III-BDNFとIV-BDNFのmRNAが増加した。3)デルタ3の過剰発現によりIV-BDNFのmRNAの増加のみが有意に増強された。4)デルタ3のATP結合部位のアミノ酸を置換させ、活性をもたない変異体を作製した。得られた変異体の過剰発現ではIV-BDNFのmRNAの発現増強は認められなかった。5)免疫染色法によりBDNF蛋白質の発現について検討した。核内にデルタ3を過剰発現する細胞の細胞質のみがBDNFに対する抗体で強く染色された。今回の結果から、神経細胞でのBDNFの発現に核内に存在するCaMキナーゼIIが関与することが明らかになった。今後、ルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子としてBDNFプロモーターの転写活性を測定する予定である。

脳由来神経栄養因子(BDNF)は特定の神経細胞に対して強い生存維持活性を持つことが知られている。また、小脳の顆粒細胞では核内のCa^<2+>濃度の上昇により、BDNFの発現が著明に増強される。すなわち、核内のCa^<2+>/カルモデュリン依存性蛋白質燐酸化酵素(CaMキナーゼ)のBDNFの発現への関与が示唆される。平成9年度にCaMキナーゼIIのデルタサブユニットに対する特異抗体を用いて、本サブユニットが小脳の顆粒細胞の核内に存在することを見出した。さらに、RT-PCR法により核内移行シグナルをもつアイソフォームであるデルタ3のcDNAを小脳から単離することに成功した。今回、デルタ3をNG108-15細胞に過剰発現させ、BDNFの遺伝子発現に対する影響について検討した。1)小脳とNG108-15細胞では、BDNFのmRNAの中でエキソンIVを含むBDNF(IV-BDNF)のmRNAが多量に発現していた。2)定量PCR法による検討では電位依存性Ca^<2+>チャネルを開口させるBay-K8644の処理により、III-BDNFとIV-BDNFのmRNAが増加した。3)デルタ3の過剰発現によりIV-BDNFのmRNAの増加のみが有意に増強された。4)デルタ3のATP結合部位のアミノ酸を置換させ、活性をもたない変異体を作製した。得られた変異体の過剰発現ではIV-BDNFのmRNAの発現増強は認められなかった。5)免疫染色法によりBDNF蛋白質の発現について検討した。核内にデルタ3を過剰発現する細胞の細胞質のみがBDNFに対する抗体で強く染色された。今回の結果から、神経細胞でのBDNFの発現に核内に存在するCaMキナーゼIIが関与することが明らかになった。今後、ルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子としてBDNFプロモーターの転写活性を測定する予定である。