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部分ペプチドを用いた蛋白質・蛋白質相互作用の解析

使用部分肽分析蛋白质-蛋白质相互作用

基本信息

批准号：
10179203
负责人：
若松馨
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Gunma University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1. G蛋白質を活性化するマストパランXがGilαに結合した時の立体構造をTRNOEで決定した。従来、TRNOEにはペプチドシグナルの分離が悪いという問題があったので、ペプチドをユビキチン融合蛋白質として発現する系を作成し、^<13>Cと^<15>Nで一様にラベルしたマストパランXを調製して、Gilα存在下で多核3次元TRNOE測定を行った。その結果、主鎖のrmsdが0.27±0.07Åという詳細な立体構造を決定することができた。また側鎖の向きも決定できた。2. レセプターがG蛋白質を活性化する機構を解析するためにマストパランがG蛋白質の二次構造に及ぼす効果をCDで調べたところ、活性化に伴ってαヘリックス含量が低下することがわかった。レセプター類似体やm2レセプターの活性化能をGilαの各種突然変異体について解析したところ、Gilαのα5ヘリックスとβ2/β3ループの間のイオンペアがレセプター結合部位からグアニンヌクレオチド結合部位へと活性化情報を伝達していることが強く示唆された。そこで、アミノ酸選択的に安定同位体ラベルしたGilαを調製しNMRで解析したところ、活性化に伴ってイオンペア近傍に構造変化が起きている事が確認された。3. m4ムスカリン性レセプターの細胞内第三ループC末端側のペプチドを大腸菌で発現させた。このペプチドはマストパランと同様にGiαとGoαを活性化した。また、レセプターとの相互作用に重要と言われているGoαのC末端5残基を欠損した突然変異体は活性化しなかったので、このペプチドはレセプターと同様にG蛋白質を活性化していると考えられる。現在、安定同位体で一様にラベルしたペプチドとGoαとの相互作用をNMRで解析している。

1. G protein activation, X, Gil alpha binding, and stereostructure determination In <13>the presence of <15>Gilα, the multi-nuclear three-dimensional TRNOE assay was performed. The result is that the rmsd of the main lock is 0.27±0.07. The detailed three-dimensional structure is determined. The direction of the side lock is decided. 2. The mechanism of activation of G protein was analyzed. The activation energy of the Lysexp analogue and m2 Lysexp can be analyzed in various sudden variants of Gilα. It is now clear that the activation information between the α5-link of Gilα and the β2/β3 Lysexp binding site and the Lysexp binding site can be transmitted from the α 5-link to the β2/β3 Lysexp binding site. The stability of the isotope was determined by NMR analysis, activation and structural transformation. 3. The third cell of m4 gene expression in E. coli was detected. This is the first time that I've seen this. The interaction between the two proteins is important, and the C-terminal 5 residues of Goα are suddenly activated. Now, stable isotopes are analyzed by NMR.