非ペプチド性運動神経栄養因子の精製と構造解析

非肽运动神经营养因子的纯化及结构分析

• 批准号: 10876025
• 负责人: 片岡 宏誌
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10876025/
• 关键词: 運動神経; 神経栄養因子; RNA; 構造解析

ニワトリ18-19日胚の骨格筋1kgから食塩水抽出、沈澱法、カラムクロマトグラフイー、HPLCによる精製により、脊髄神経細胞に対して生存維持活性を示す物質の精製を行った。その結果、最終段階の逆相HPLCでブロードではあるが、単一なピークとして活性物質を得た。最終精製物は258nmに最大吸収をもつことから予想通り、非ペプチド性物質であると考えられた。プロトンNMRではいずれのシグナルもブロードであったことから、活性物質はポリマー分子であることが予想された。また、リボース、プリン環およびピリミジン環に由来するプロトンシグナルが観測されたことからRNAである可能性が示唆された。そこで、粗抽出物について核酸抽出の常法であるフェノール・クロロホルム抽出、さらにエタノール沈澱を行い、試料中の活性を調べたところ、活性は完全に維持されていた。また、このエタノール沈殿物および最終精製物についてRNase、DNase、Proteinaseによる失活実験を行ったところ、DNaseおよびProteinase処理では活性は維持されたが、RNaseによってほぼ完全に活性が失われた。以上の結果からニワトリ胚骨格筋に含まれる脊髄神経細胞に対して生存活性を示す物質はRNAであると結論した。次に最終精製物であるRNAの配列を明らかにするため化学修飾分解法および塩基特異的切断酵素を用いた酵素分解法を併用して配列分析を行った。しかし、最終精製物の純度が低いために確実な配列を明らかにすることができなかった。現在、最終精製物をポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製し、配列分析を行っている。

18-19 days embryo bone marrow 1kg, water extraction, precipitation method, purification by HPLC, purification of substances for survival maintenance activity in spinal nerve cells Results: Reversed phase HPLC of final stage was used to obtain the active substance. The final product has a maximum absorption of 258nm. The NMR spectrum shows that there is no such thing as an active substance. The ability to detect RNA is demonstrated by the ability to detect RNA from the source. In addition, the crude extract is extracted from the nucleic acid, and the activity in the sample is completely maintained. The activity of RNase, DNase and Proteinase was completely inactivated in the final product. The above results show that there is no significant difference between the two groups. The final product was prepared by chemical modification and enzyme digestion. The purity of the final product is low and the composition is accurate. Now, the final product is refined by electrokinetic analysis.