非ペプチド性運動神経栄養因子の精製と構造解析

非肽运动神经营养因子的纯化及结构分析

基本信息

批准号：
10876025
负责人：
片岡宏誌
金额：
$ 1.22万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10876025/
关键词：
運動神経神経栄養因子 RNA 構造解析

项目摘要

ニワトリ18-19日胚の骨格筋1kgから食塩水抽出、沈澱法、カラムクロマトグラフイー、HPLCによる精製により、脊髄神経細胞に対して生存維持活性を示す物質の精製を行った。その結果、最終段階の逆相HPLCでブロードではあるが、単一なピークとして活性物質を得た。最終精製物は258nmに最大吸収をもつことから予想通り、非ペプチド性物質であると考えられた。プロトンNMRではいずれのシグナルもブロードであったことから、活性物質はポリマー分子であることが予想された。また、リボース、プリン環およびピリミジン環に由来するプロトンシグナルが観測されたことからRNAである可能性が示唆された。そこで、粗抽出物について核酸抽出の常法であるフェノール・クロロホルム抽出、さらにエタノール沈澱を行い、試料中の活性を調べたところ、活性は完全に維持されていた。また、このエタノール沈殿物および最終精製物についてRNase、DNase、Proteinaseによる失活実験を行ったところ、DNaseおよびProteinase処理では活性は維持されたが、RNaseによってほぼ完全に活性が失われた。以上の結果からニワトリ胚骨格筋に含まれる脊髄神経細胞に対して生存活性を示す物質はRNAであると結論した。次に最終精製物であるRNAの配列を明らかにするため化学修飾分解法および塩基特異的切断酵素を用いた酵素分解法を併用して配列分析を行った。しかし、最終精製物の純度が低いために確実な配列を明らかにすることができなかった。現在、最終精製物をポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製し、配列分析を行っている。

通过盐水提取，沉淀，柱色谱法和HPLC，将表现出对脊柱神经细胞的生存维护活性的物质从第18-19个胚胎上的1公斤骨骼肌肉中纯化。结果，在最后阶段，通过反向相位的HPLC获得了活性物质作为单个峰（尽管宽）。正如预期的那样，最终纯化的产物被认为是一种非肽材料，因为它在258 nm处具有最大吸收。质子NMR预测活性物质是聚合物分子，因为两个信号都广泛。此外，观察到源自核糖，嘌呤和嘧啶环的质子信号，表明它们可能是RNA。因此，使用苯酚 - 氯仿，一种用于提取核酸的常规方法和乙醇沉淀进行了粗糙的提取，并检查了样品中的活性，并完全维持了活性。此外，当使用RNase，DNase和蛋白酶停用乙醇沉淀和最终纯化产物时，将活性保持在DNase和蛋白酶处理中，但由于RNase而几乎完全损失了活性。从以上结果得出结论，RNA是对鸡胚胎骨骼肌中包含的脊髓神经细胞表现出可行活性的物质。接下来，为了阐明RNA的序列，即最终纯化的产物，使用化学修饰的降解方法和酶促降解方法进行了序列分析。但是，由于最终纯化产品的纯度较低，因此无法澄清可靠的序列。目前，最终纯化的产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和序列分析纯化。