微少注入法を利用した精細胞分化のin vivo 実験系の確立と応用

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本年度は、昨年度に確立した精巣内精細管/精巣上体管(マウスとラット)ヘの微小注入法を用いて、注入された抗体や薬物が生体内の生殖細胞や体細胞に結合できるか、それらがどんな影響を及ぼすのかなどについて形態学的解析を行った。さらに、精巣構成細胞への遺伝子DNA導入や雌性生殖管への微小注入実験を試みた。【1】抗体の注入:精子鞭毛表面と精巣上体主細胞を認識する単クローン抗体(mMC31とmMC81)を精巣上体管へ微小注入した。経時的に精巣上体を固定し、抗体の鞭毛表面や精巣上体分泌物への結合能について免疫組織化学的に検索した。その結果、精巣上体遠位部(尾部)精子のうち約60%の精子鞭毛表面にmMC31陽性反応を認めた。【2】薬物の注入:先体内部抗原を認識する抗体(mMN7など)やゴルジ装置の可逆的阻害剤Brefeldin Aを精細管内に濃度を変えて微小注入した。経時的に精巣を固定して光顕・電顕観察を行い、それらの先体形成に及ぼす影響を調べた。現在、得られたデータを詳しく解析している。【3】遣伝子DNAの導入:若齢動物の精細管にDNA-カチオン性脂質結合液(pCMV-beta-galプラスミドDNA)を微小注入した。経時的に精巣のX-gal染色を行い、遺伝子導入細胞の有無を調べた。現在のところ、陽性所見は得られていない。【4】卵管への微小注入:精子先体を認識する単クローン抗体(mMN9など)を雌マウスの卵管采へ微小注入し、直後に自然交配させた。腟栓確認後、開腹して着床の有無および胎児数を調べた。その結果、mMN9が生体内受精に影響を及ぼすことを示唆する所見を得た。