ブタ精祖細胞表面に対する特異的単クローン抗体の作製および精祖細胞単離法の開発

家畜の精子形成機序を解明するための第一歩として、精巣から精祖細胞を単離および培養する技術を開発することは重要と考えられる。そこで本研究は、ブタの精祖細胞を認識する特異的単クローン抗体を作製し、これを用いて精祖細胞を単離する方法を開発することを目的として行った。まず、これまで家畜の精巣から精巣構成細胞のそれぞれを効率よく分離する技術が確立されてなかったため、精巣から精細管と間質細胞とを分離する方法の確立を試みた。その結果、ディスパーゼ処理により間質組織を消化した後精細管を単離し、さらにこの単離精細管をコラゲナーゼ処理することによって精細管構成細胞を分離することが可能となった。この方法は、ブタのみでなくヤギやウシの精巣にも応用可能であることを確かめた。こうして分離した精細管構成細胞(1×10^7個)を6週令のBALB/cマウスに腹腔投与した(初回免疫)。2〜3週間後、同細胞で追加免疫を行った。3〜4日後、免疫マウスから無菌滴に取り出した脾臓から脾細胞を調製し、マウス骨髄腫細胞と細胞融合させた。融合細胞から抗体産生クローンをELISA法により選抜し、さらに特異的抗体産生クローンを免疫組織染色法を用いて検定した。その結果、8種類のクローンが精細管細胞と結合することが判明した。これらの抗体のなかで3種類は主に細胞表面に結合することが観察されたが、精細管基底膜に接する細胞(精祖細胞)と結合するものはこれまでのところ得られていない。次に、細胞表面に結合する単クローン抗体を用いて、パンニング法による細胞単離を試みたところ、純度の高い細胞集団を回収することがセルソーターによる解析の結果から確かめられた。

家畜の精子形成機序を解明するための第一歩として、精巣から精祖細胞を単離および培養する技術を開発することは重要と考えられる。そこで本研究は、ブタの精祖細胞を認識する特異的単クローン抗体を作製し、これを用いて精祖細胞を単離する方法を開発することを目的として行った。まず、これまで家畜の精巣から精巣構成細胞のそれぞれを効率よく分離する技術が確立されてなかったため、精巣から精細管と間質細胞とを分離する方法の確立を試みた。その結果、ディスパーゼ処理により間質組織を消化した後精細管を単離し、さらにこの単離精細管をコラゲナーゼ処理することによって精細管構成細胞を分離することが可能となった。この方法は、ブタのみでなくヤギやウシの精巣にも応用可能であることを確かめた。こうして分離した精細管構成細胞(1×10^7個)を6週令のBALB/cマウスに腹腔投与した(初回免疫)。2〜3週間後、同細胞で追加免疫を行った。3〜4日後、免疫マウスから無菌滴に取り出した脾臓から脾細胞を調製し、マウス骨髄腫細胞と細胞融合させた。融合細胞から抗体産生クローンをELISA法により選抜し、さらに特異的抗体産生クローンを免疫組織染色法を用いて検定した。その結果、8種類のクローンが精細管細胞と結合することが判明した。これらの抗体のなかで3種類は主に細胞表面に結合することが観察されたが、精細管基底膜に接する細胞(精祖細胞)と結合するものはこれまでのところ得られていない。次に、細胞表面に結合する単クローン抗体を用いて、パンニング法による細胞単離を試みたところ、純度の高い細胞集団を回収することがセルソーターによる解析の結果から確かめられた。