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培養肝細胞を用いた肝臓の再構築-ミクロ肝臓の作製-

使用培养肝细胞进行肝脏重建 - 微肝脏的制备 -

基本信息

批准号：
10878159
负责人：
松下通明
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至 1999
项目状态：
已结题

项目摘要

ミクロ肝臓の作成および機能維持を目標に、今年度は以下の実験を行った。1.ラットミクロ肝臓作成法の検討1)細胞分散法の検討昨年度に引き続きミクロ肝臓作成に適した細胞分散法を検討し、専用の灌流装置を制作した。得られた細胞を回旋培養すると4〜6時間でミクロ肝臓が形成されることが判明した。2)非実質細胞との混合培養上記分散法では、実質細胞分画にも豊富に非実質細胞が含まれることが判明した。これを用いて作製したミクロ肝臓は約70μmで、実質細胞に対して約30%の非実質細胞が含まれていた。さらに内皮細胞 : kupffer細胞はおよそ10:3であった。2.ブタミクロ肝臓作成法の検討1)屠殺ブタを用いた細胞分散法の検討食肉センターから入手した屠殺直後のブタ肝臓を用いてコラゲナーゼ濃度、ディスパーゼ、ヒアルロニダーゼの有無、灌流液中のEGTAの有無、カルシウム濃度について検討したが、肝臓の状態に左右され、最適条件を設定することは不可能であった。2)生ブタを用いた細胞分散法の検討10Kg程度のブタを全麻下に肝潅流を行い、生細胞率95〜99%の肝細胞が採取できることを確認した。この肝細胞でラットと同様に培養を行うと、ブタミクロ肝臓がラットの10倍の細胞濃度の条件でも作製されることが判明した。3.肝細胞スフェロイドの評価1) 形態学的観察共焦点レーザー顕微鏡を用いてラットミクロ肝臓の評価を行った。非実質細胞はほとんどが外側に接着、内部は立方体をした肝細胞からなっており、生体内の細胞極性を保ちつつミクロ肝臓を作製することに成功した。2) 機能評価ラットミクロ肝臓を長期培養すると、尿素合成能は1〜2日をピークに減少する。それと同時に単層化してゆきスフェロイド形態は消失するが、コラーゲンゲルを用いて培養すると形態・機能ともに維持されることが判明した。

This year, the following tasks were carried out: 1. Study on the preparation method of cell dispersion method 1) Study on the preparation method of cell dispersion method After 4 ~ 6 hours of rotational culture, the formation of liver cells was identified. 2)Non-cytoplasmic cell culture is characterized by the separation of cytoplasmic cells and non-cytoplasmic cells. The size of the cells is about 70μm, and about 30% of the cells are non-cellular. Endothelial cells: kupffer cells 10:3. 2. Study on preparation method of liver cancer 1) The concentration of EGTA in perfusate, the state of liver cancer, the optimal setting of conditions. 2)10Kg of liver cells were detected by cell dispersion method, and the rate of liver cells was 95 ~ 99%. The liver cells were cultured in the same way and the results were determined by the 10-fold cell concentration. 3. Evaluation of liver cells 1) Morphological observation using confocal microscope to evaluate liver cells. Non-cytoplasmic cells are connected to the outside, the inside is cubic, and the polarity of cells in the organism is protected. 2)Functional evaluation: Long-term cultivation of urea and urea synthesis can be reduced in 1 ~ 2 days. It is clear that the morphology and function of the cells are maintained in the culture medium.