Reverse footprint - Analyse der Kontakte in DNA-Protein-Komplexen

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Wir haben eine sogenannte reverse footprint Technik etabliert, mit deren Hilfe die Aminosäurereste eines Proteins identifziert werden können, die direkt an der Wechselwirkung eines Proteins mit seinem spezifischen DNA-Substrat beteiligt sind. Es ist beabsichtigt, mit dieser Technik die DNA-Bindungsregion verschiedener Nukleasen im Detail zu charakterisieren, insbesondere bei der GTP-abhängigen McrBC Restriktionsendonuklease und dem ATP-abhänigigen MutHLS DNA-Reparatursystem, die beide methylierte bzw. hemimethylierte DNA erkennen und die DNA unter GTP-bzw. ATP-Hydrolyse spalten. Wir wollen mit Hilfe von laserinduzierten photocrosslinks die Regionen der Proteine sondieren, die sich im direkten Kontakt mit der DNA befinden und eruieren, wieweit sich diese Kontakte im Zuge der Reaktion, an der mehrere Komponenten beteiligt sind, verändern. Dazu sollen unter Verwendung einer pulsed flow Apparatur auch zeitaufgelöste photocrosslink Experimente durchgeführt werden. In diesem Zusammenhang soll auch geklärt werden, wie sich McrBC bzw. MutHLS während der Reaktion auf der DNA bewegen, um von der initialen Erkennungstelle zu der weit entfernten Schnittstelle zu gelangen.