コンビケムを用いた糖鎖認識ペプチドリガンドの取得

1)糖鎖を認識するペプチド配列のスクリーニング多糖(キチン,セルロース)を標的として、M13ファージランダムペプチドライブラリーを探索源として、カラム法および、磁気ビーズ法を用いてスクリーニングを行った。結果として、chito-agaroseカラムをマトリクスにして、水素結合を強調する条件(60%EtOH)で洗浄後、水素結合を弱める条件(高濃度糖、高濃度多価アルコール)で溶出を試みたが、数ラウンド後に急激な回収率の低下が認められた。また、cellulose磁気ビーズをマトリクスにして、上記と同様の洗浄・溶出条件でセレクションを行ったが、同様に数ラウンド後に回収率が低下した。上記の磁気ビーズセレクションと同様の吸着・洗浄の後にフェノールによる強制溶出を行うセレクションを行い、4ラウンド後にシークエンス解析を行ったところ、グリシン出現頻度の低下およびプロリン出現頻度の上昇が観測された。磁気ビーズを直接感染させてファージ増幅率を調べたところ、3時間感染と5時間感染との間で顕著な違いが無かった。それらの結果から、中性糖の認識能とM13ファージ感染能との間に負の相関が示唆された。2)糖鎖を認識DNAアプタマ-の取得59残其のランダムDNAライブラリーからインビトロセレクション法により取得したキチンを認識するDNAアプタマ-の選択性を評価し、下記の仮説を得た。DNAアプタマ-が多糖を認識するには、バルジループあるいは、ステムループ等のループ構造が必須である。(G-カルテット構造ではない。)類似多糖類に対する選択性は、ループの数が3個以上の場合高くなる。ループ数が1の場合は、糖に対する親和性は認められるが基質認識能は低い。

1)糖鎖を認識するペプチド配列のスクリーニング多糖(キチン,セルロース)を標的として、M13ファージランダムペプチドライブラリーを探索源として、カラム法および、磁気ビーズ法を用いてスクリーニングを行った。結果として、chito-agaroseカラムをマトリクスにして、水素結合を強調する条件(60%EtOH)で洗浄後、水素結合を弱める条件(高濃度糖、高濃度多価アルコール)で溶出を試みたが、数ラウンド後に急激な回収率の低下が認められた。また、cellulose磁気ビーズをマトリクスにして、上記と同様の洗浄・溶出条件でセレクションを行ったが、同様に数ラウンド後に回収率が低下した。上記の磁気ビーズセレクションと同様の吸着・洗浄の後にフェノールによる強制溶出を行うセレクションを行い、4ラウンド後にシークエンス解析を行ったところ、グリシン出現頻度の低下およびプロリン出現頻度の上昇が観測された。磁気ビーズを直接感染させてファージ増幅率を調べたところ、3時間感染と5時間感染との間で顕著な違いが無かった。それらの結果から、中性糖の認識能とM13ファージ感染能との間に負の相関が示唆された。2)糖鎖を認識DNAアプタマ-の取得59残其のランダムDNAライブラリーからインビトロセレクション法により取得したキチンを認識するDNAアプタマ-の選択性を評価し、下記の仮説を得た。DNAアプタマ-が多糖を認識するには、バルジループあるいは、ステムループ等のループ構造が必須である。(G-カルテット構造ではない。)類似多糖類に対する選択性は、ループの数が3個以上の場合高くなる。ループ数が1の場合は、糖に対する親和性は認められるが基質認識能は低い。