ヒト癌細胞シスプラチン感受性決定因子としてのDNA損傷修復分子機構の解析

DNA损伤修复分子机制作为人类癌细胞顺铂敏感性决定因素的分析

• 批准号: 11140234
• 负责人: 高田 穣
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11140234/
• 关键词: DNA相同組換え; Rad51; ジーンターゲティング; ヌクレオチド除去修復

(1)Rad51ファミリーのニワトリ対応遣伝子をすべて単離しターゲティングコンストラクトを作成してジーンターゲティングを行い、5種類のRad51ファミリーすべてのミュータント細胞株を樹立した。これらの細胞株は以下の諸点においてほぼ同一の表現型を示した。すなわち、増殖の著明な緩徐化、死細胞の増加、染色体断裂の増加、ジーンターゲティング効率の極度の低下、sister chromatid exchange(SCE)出現頻度の低下、シス・MMCなどクロスリンカーに対する高感受性、ガンマ線に軽度感受生などである。ヒト・マウスの対応遺伝子の導入によって、調べ得た範囲で少なくともγ線・シスの感受性や死細胞数増加などの表現型が抑制された。したがって、Rad51ファミリーの各遺伝子は高等真核生物のHR分子機構に必須であり、染色体安定性やDNAクロスリンク修復において重要と考えられる。興味深いことにシスやγ線に対する感受性はヒトRad51を強制発現させることで部分的ではあるが正常化した。(2)DT40のミュータント細胞においてRad51ファミリーのおのおののヒトあるいはマウスのcDNAを導入すると、野生型のDT40よりシスに対してより耐性になるという現象が見られた。そこでヒト肺ガン細胞株SBC3にヒトRad51BやRad51Cの強制発現を試みた。タグ付きのコンストラクトをトランスフェクトしウェスタンを行ったが、明瞭な発現を示すクローンを得ることができなかった。このファミリーの遺伝子が強発現すると細胞死が誘導される可能性がある。(3)シス処理等によるDNAダメージ後核内には抗Rad51抗体で明瞭に検出されるフォーカスが形成される。NERに必須なERCC1分子とXPA分子はそれぞれヒト患者から樹立された欠損細胞株があるが、特に前者でインターストランドクロスリンクに感受性が高いとされている。ERCC1はDNA損傷の5'側にニックを入れるエンドヌクレアーゼを構成するサブユニットであり、出芽酵母の対応するタンパクはある種のHRに関与することが知られている。そこでこれらの欠損細胞株でシス処理後のRad51フォーカス形成をアッセイしたが、フォーカスは特に問題なく形成された。(4)上記Rad51ファミリーのミュータント細胞におけるRad51フォーカス形成をMMC、γ線による処理後にアッセイした。各ミュータント細胞においては野生型とは異なり、フォーカスの大きさ輝度とも極度に低下して明瞭なフォーカス形成が消失していると考えられた。(5)HRとNERのダブルノックアウト株作成のため、ニワトリのERCC1とXPAの単離を試みた。XPAはすでにcDNA配列が報告されており、ゲノムDNAの分離も容易であったが、ERCC1はcDNAはとれたもののゲノムの単離に難渋している。ライブラリースクリーニングを行う予定である。XPAは現在ターゲティングコンストラクトを作成し、トランスフェクションを行っている。

(1)Rad 51 cell lines were established in five types of Rad51 cells. The cell lines showed the same phenotype at the following points: The increase of chromosome breakage, the extremely low frequency of chromosome breakage, the low frequency of sister chromatid exchange(SCE), the high sensitivity of MMC to chromosome breakage, the high sensitivity of chromosome breakage, and the high sensitivity of chromosome breakage. The expression of the gene is inhibited by the induction of the gene, the modulation of the gene, the increase of the sensitivity of the gene and the increase of the phenotype. The DNA sequence of Rad51 is essential for higher eukaryotes to develop HR molecular machinery, chromosome stability and DNA repair. The sensitivity of Rad51 is stressed and normalized. (2)DT40 gene expression in the cell line Rad51 was detected in the cell line Rad51, and the expression in the cell line Rad51 was detected in the cell line Rad51. The stress response of cell line SBC3 was tested by Rad 51B and Rad 51C. The first step is to make sure that you have a clear understanding of the situation. The possibility of cell death induced by the presence of these genes is discussed. (3)After the treatment of DNA damage, nuclear anti-Rad 51 antibody was detected and the formation of DNA damage was investigated. ERCC1 and XPA molecules are highly susceptible to the development of defective cell lines in patients, especially in the former. It is known that ERCC1 is involved in the HR of various species such as budding yeast and forms a support network for the 5'side of DNA damage. The Rad51 cell line was treated with this method, and the Rad51 cell line was treated with this method. (4)Rad 51 is a new type of cell, and it is a new type of cell after MMC and gamma ray treatment. Each cell has a wild type and a large brightness, which is extremely low. (5)HR NERCC1 and XPA are the most important parts of the system. XPA cDNA alignment is easy to isolate and ERCC1 cDNA alignment is difficult to isolate. The color of the film is different from the color of the film. XPA is now in the process of developing and implementing the project.

项目成果

Sonoda E., Sasaki M. S., Morrison C., Yamaguchi-Imai Y., Takata M., Takeda S.: "Sister chromatid exchanges are mediated by homologous recombination in vertebrate cells"Mol Cell Biol. 19. 5166-5169 (1999)

Sonoda E.、Sasaki M.S.、Morrison C.、Yamaguchi-Imai Y.、Takata M.、Takeda S.：“姐妹染色单体交换是由脊椎动物细胞中的同源重组介导的”Mol Cell Biol。

Morrison C., Shinohara A., Sonoda E., Yamaguchi-Imai Y., Takata M., Weichselbaum RR., Takeda S.: "The Essential functions of human Rad51 are independent of ATP hydrolysis"Mol Cell Biol. 19. 6891-6897 (1999)

Morrison C.、Shinohara A.、Sonoda E.、Yamaguchi-Imai Y.、Takata M.、Weichselbaum RR.、Takeda S.：“人 Rad51 的基本功能独立于 ATP 水解”Mol Cell Biol。

Yamaguchi-Iwai Y,Sonoda E,Sasaki M S,Morrison C.Yagi T,Takeda S: "Mrell is essential for the maintenance of chromosomal DNA in vertebrate cells"EMBO J. 18. 6619-6629 (1999)

Yamaguchi-Iwai Y、Sonoda E、Sasaki MS、Morrison C.Yagi T、Takeda S：“Mrell 对于脊椎动物细胞中染色体 DNA 的维持至关重要”EMBO J. 18. 6619-6629 (1999)

Takata M.,Sasaki M.S.,Sonoda E.,Fukushima T.,Takeda S.: "The Rad51 Paralog Rad51B Promotes Homologous Recombinational Repair"Mol Cell Biol. (in press).

Takata M.、Sasaki M.S.、Sonoda E.、Fukushima T.、Takeda S.：“Rad51 Paralog Rad51B 促进同源重组修复”Mol Cell Biol。